Tipos de microscopios ópticos

Antes de abordar los tipos de microscopios ópticos, es imprescindible contar con una base. Ésta se adquiere entendiendo la importancia de un microscopio y sabiendo lo que es un microscopio óptico. Y este no será el final del camino, ya que por delante nos quedarán los microscopios electrónicos.

Tipos de microscopios ópticos

Cuando desarrollábamos la temática del microscopio óptico, pusimos de manifiesto los diferentes tipos existentes.

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En esta entrada desarrollaré cada tipo de microscopio óptico por separado. Incidiré en sus virtudes y trataré de desarrollar su funcionamiento textualmente y de forma gráfica (ésto, al menos en la mayoría).

Microscopio óptico de campo brillante o campo luminoso

De entre los tipos de microscopios ópticos existentes, éste es el más común y el más utilizado. Su funcionamiento está explicado en la entrada sobre el microscopio óptico, ya que es la base de desarrollo del resto de tipos de microscopios existentes.

Microscopio de campo brillanteMicroscopio óptico de campo brillante o de campo luminoso

En esta práctica y en esta otra podemos ver ejemplos de la utilización de este tipo de microscopio, así como los resultados de su uso con determinadas preparaciones.

Microscopio óptico de campo brillanteUso del microscopio óptico de campo brillante con objetivos secos

Observación al microscopioUso del microscopio óptico de campo brillante con una preparación en fresco (sedimento urinario)

Microscopio de campo oscuro

Este microscopio es, en esencia, un microscopio de campo brillante, con una modificación sensible en su diafragma. En lugar de un diafragma de tipo iris, se instala un diafragma de campo oscuro en el microscopio. Este dispositivo impide que los rayos de luz que salen del condensador incidan directamente en la preparación, permitiendo que solo incidan en ella rayos de luz que llegan a la preparación de manera oblicua.

tipos de microscopios opticos

El diafragma de campo oscuro no es más que un disco opaco que obtura el cilindro de luz del condensador. Gracias a él, al objetivo solo llegan los haces de luz que son dispersados por los objetos de la preparación. De este modo, dichos objetos aparecen brillantes sobre un fondo oscuro.

Esta microscopía ha sido esencial en la observación del Treponema Pallidum, agente causal de la sífilis. A través de un microscopio de campo oscuro se pueden observar células y microorganismos vivos que no son observables con el microscopio de campo brillante debido a la falta de contraste.

Microscopio de contraste de fase

Frits Zernike ideó el microscopio de contraste de fase en el año 1949. Este microscopio permite ver objetos transparentes, o incoloros, que no presentan contraste con la luz. Se utiliza para visualizar células vivas y revelar detalles de su estructura interna. En hematología se utiliza para algunos recuentos de plaquetas, en microbiología para el estudio de las estructuras internas de los microorganismos y en bioquímica para el estudio del sedimento urinario.

El microscopio de contraste de fase es, en esencia, un microscopio de campo brillante con dos añadidos:

  • Diafragma anular: A diferencia del tipo iris, este diafragma solo deja pasar la luz a través de una línea circular. Al atravesarlo, la luz forma un cilindro hueco que ilumina la preparación.
  • Placa anular de fase: Es una lente que se añade al sistema de lentes del objetivo. Esta placa enlentece los rayos de luz procedentes del condensador, y es indispensable que se encuentre alineada con el diafragma.

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El fundamento del funcionamiento de este microscopio es el siguiente: La luz es una onda sinusoidal caracterizada por su amplitud y su longitud de onda. El brillo, o intensidad, depende de la amplitud de onda, y el color viene determinado por la longitud de onda.

Si la luz atraviesa un objeto absorbente, la radiación transmitida se reduce en intensidad. Sin embargo, si atraviesa un medio transparente la intensidad es la misma, pero se provoca una perturbación que ocasiona un retardo en la onda. Este retardo origina una diferencia de fase que el ojo no es capaz de detectar, y tampoco la placa fotográfica. El microscopio de contraste de fase convierte esta diferencia de fase en diferencias de intensidad, que sí son perceptibles para nuestro ojo.

Microscopio de luz polarizada

Este microscopio se sirve de la luz polarizada para obtener imágenes a color, dependiendo del grado de giro que sufra el rayo de luz al incidir sobre cada uno de los puntos de la muestra. Su uso está extendido en mineralogía, y en el laboratorio clínico y biomédico se utiliza para determinar cristales en diferentes líquidos biológicos.

Se diferencia de un microscopio de campo brillante en el uso de dos lentes de polarización. Una de estas lentes, el polarizador, se sitúa entre la fuente luminosa y la muestra. La otra lente, el analizador, se situa entre la muestra y los oculares. La función de estas lentes es dejar pasar solo los rayos de luz que vibren en un determinado plano. Dichas lentes son prismas de Nicol o polaroides artificiales.

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De la luz que llega al polarizador, solo pasa aquella que vibra en el plano de polarización previsto. El analizador cuenta con un plano de polarización perpendicular al del polarizador, ésto permite que el rayo de luz que atraviesa el polarizador, al llegar al analizador, se extinga al no coincidir con el plano de polarización. Esto da como resultado la visualización de un campo oscuro.

Tipos de microscopio óptico

En el caso de que entre el polarizador y el analizador se encuentre una sustancia anisótropa (divide el rayo de luz polarizada en dos rayos de luz con distinta velocidad de propagación), el rayo de luz polarizada se divide y modifica su plano de vibración. Llegados a este punto, el analizador solo deja pasar parte de los rayos que coinciden con su plano de polarización. Esos rayos son los que forman la imagen coloreada que observamos a través de los oculares.

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Microscopio de interferencia

El microscopio de interferencia es, en esencia, un microscopio de contraste de fase que incorpora una lente situada por debajo de la preparación. Esta lente separa cada rayo de luz en dos rayos. Un rayo de luz atraviesa la muestra en un punto y el otro lo hace en un punto situado justo al lado.

El haz que ha atravesado el objeto se ha retardado, ha sufrido un cambio en su fase, en comparación con el haz directo. Finalmente, ambos rayos se reunen, interfiriendo entre sí y produciendo una imagen contrastada del objeto.

A diferencia del microscopio de contraste de fase, el microscopio de interferencia es más sensible con la variación de los índices de refracción.

Microscopio de contraste diferencial interferencial

El microscopio de contraste diferencial interferencial combina los sistemas ópticos de los microscopios de luz polarizada e interferencia. Los rayos de luz polarizada son divididos en dos antes de atravesar la muestra. Y posteriormente son unidos nuevamente antes de llegar al analizador.

De este modo se consigue cierto relieve en las imágenes y un buen contraste. Pero para conseguirlo y combinar ambos sistemas es necesario que el microscopio cuente con:

  • Polarizador en el condensador.
  • Dos prismas de Wollaston situados en dos lugares diferentes en el recorrido de los rayos.
  • Objetivos que no giren el plano de vibración o polarización.
  • Analizador.

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Microscopio de Luz Ultravioleta (UVA)

El límite de resolución del microscopio óptico de campo luminoso, o brillante, es de 200 nm. Con el microscopio de luz UVA duplicamos el poder de resolución anterior. Esto es debido a que la longitud de onda de la luz UVA es de 180-340 nm.

El problema es que las radiaciones UVA son invisibles al ojo humano, y las imágenes obtenidas deben ser recogidas en fototubos, que los transmiten a una placa fotográfica o a una pantalla de televisión.

Apenas se utiliza porque es muy difícil su uso, pero ha sido la base para la construcción del microscopio de fluorescencia. Además, la radiación ultravioleta es lesiva para el ojo humano.

Microscopio de Fluorescencia

Fluorescencia es la luz visible que emiten determinadas sustancias al ser excitadas con una luz de longitud de onda corta. La luz ultravioleta es la luz utilizada en este tipo de casos, ya que su longitud de onda es adecuada. Las sustancias que emiten luz fluorescente se denominan sustancias fluorescentes o fluorocromos.

El microscopio de fluorescencia es un microscopio diseñado para observar la luz fluorescente emitida por la muestra. Previamente, la muestra debe ser excitada con luz ultravioleta.

Los componentes de este microscopio son:

  • Lampara de mercurio: Emite luz en una banda de longitudes de onda que van desde el ultravioleta al infrarrojo.
  • Filtro de Excitación: Sólo deja pasar la luz UVA, que finalmente atravesará la muestra.
  • Filtro barrera: Se coloca entre el objetivo y los oculares. Este filtro no deja pasar la luz ultravioleta. De este modo al observador solo le llega la luz fluorescente emitida por la muestra tras la excitación con rayos UVA.

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Fluorocromos

Los fluorocromos absorben a una determinada longitud de onda y emiten en longitud de onda mayores. Esto nos permite obtener imágenes que con el microscopio de luz UVA no obtendríamos. La fluorescencia puede ser de tres tipos:

  • Fluorescencia primaria: Es la fluorescencia natural o autofluorescencia. Son las que tienen sustancias como la vitamina A, la vitamina B1 (Tiamina), la riboflavina, la clorofila o la proteína fluorescente verde (GFP).
  • Fluorescencia secundaria: La muestra es marcada por fluorocromos. Éstos pueden ser Rodamina B, Auramina o Isocianato de Fluoresceina. Una de las aplicaciones es la tinción de auramina para visualizar el Mycobacterium Tuberculosis, más conocido como Bacillo de Koch.
  • Fluorescencia terciaria: También conocida como inmunofluorescencia. En estas técnicas el antígeno o el anticuerpo son marcados con fluorocromos, que nos van a permitir identificar en el paciente el anticuerpo o el antígeno correspondiente. Para poder medir o cuantificar la fluorescencia se utilizan determinados equipos como el citómetro de flujo o los escáneres de fluorescencia.

Microscopio Confocal

El microscopio confocal es el último de los tipos de microscopios ópticos que vamos a ver. Este microscopio nos permite eliminar la señal procedente de las zonas fuera de plano del foco en la muestra. De este modo obtenemos imágenes de mayor resolución espacial con detalles volumétricos y de textura que no se logran con otras técnicas. También nos permite realizar reconstrucciones tridimensionales.

Un microscopio confocal cuenta con una serie de elementos:

  • Fuente de luz: Es un rayo láser de Argón con una longitud de onda situada entre 488 y 514 nm. El láser tiene líneas de excitación independientes y se pueden seleccionar de manera individual.
  • Excitación de la muestra: Se realiza punto por punto barriendo el área de interés para obtener una imagen completa. Es lo que se denomina excitación point scanning, punto por punto.
  • Emisión de la luz: La luz emitida por cada punto de la muestra se descompone por un prisma dicroico en los distintos componentes del espectro. Esa luz es enfocada en una ranura, o pinhole, y es la única que llega al observador.

En esta microscopía encontramos las siguientes ventajas:

  • Permite la observación de tejidos intactos sin necesidad de realizar cortes histológicos.
  • Un aumento de la resolución muy notable.
  • Permite reconstrucciones tridimensionales del objeto en estudio.

Sin embargo, también cuenta con una serie de desventajas:

  • Dificultad de manejo.
  • Coste elevado.
  • Limitación de las líneas de excitación al número de láseres disponibles.

Además del microscopio confocal de láser de barrido, existen otros dos tipos de microscopio confocal. Éstos son: el microscopio confocal de disco giratorio (disco de Nipkow) y microscopios de matriz programable. Estos dos tipos contaban con menor calidad de imagen pero con una ventaja determinante como era la tasa de FPS (frames per second) a la hora de la grabación. Actualmente el microscopio confocal de láser de barrido ha sido mejorado hasta el punto de que permite grabaciones con una alta tasa de frames (60 FPS).

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