Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen

La tinción diferencial de Ziehl-Neelsen es una práctica que realicé en la asignatura de microbiología clínica. Durante el segundo curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.

Objetivo

Diferenciar las bacterias ácido-alcohol resistentes (AAR) de las que no lo son. Usando, para ello, la tinción diferencial de Ziehl-Neelsen.

Fundamento

Debido a la composición de la “pared” bacteriana no es fácil teñir diversos microorganismos como el mycobacterium. Por tanto hay que forzarlo con calor.

Además, al tratarse de una tinción diferencial, es necesario el uso de más de un colorante para poner de manifiesto la afinidad por ciertos colorantes de determinados microorganismos o estructuras de los mismos. Esta afinidad puede definirse como la “fuerza” con la que queda retenido el colorante, que no se elimina con ácido-alcohol.

Tinción diferencial de Ziehl-Neelsen

Es una tinción diferencial ideada por dos médicos alemanes, Franz Ziehl, un bacteriólogo, y Friedrich Neelsen, un patólogo. Su finalidad es la de identificar mycobacterias (fuertemente ácido-alcohol resistentes), nocardias (débilmente AAR), actinomices (débilmente AAR) o parásitos como cryptosporidium.

Las bacterias ácido-alcohol resistentes no pueden ser clasificados según la tinción de Gram, la técnica más común en la microbiología actual. Sin embargo pueden ser teñidas con algunas tinciones combinadas con calor, como la de Ziehl-Neelsen. Una vez teñidas tienen la capacidad de resistir la decoloración de una combinación de alcohol/ácido, el decolorante más común en los protocolos de tinción de bacterias.

En la práctica realizamos la tinción tradicional, aunque existen dos variantes más. Una de ellas es la denominada variante en frío o Tinción de Kinyoun. Y la otra es la variante histológica destinada a la búsqueda e identificación de microorganismos AAR en tejidos.

Material y reactivos

  • Cepa de Mycobacterium flei (o phlei), no patógena, sembrada en agar sangre sobre una placa de petri.
  • Carbofucsina.
  • Alcohol/ácido (3 ml de HCl 0.36N en 100 ml de etanol de 96º).
  • Azul de metileno al 0.3%
  • Agua destilada.
  • Portaobjetos.
  • Asa de siembra de platino.
  • Mechero Bunsen.
  • Cubeta.
  • Barras de tinción.
  • Pipetas pasteur de plástico.
  • Papel de filtro.
  • Microscopio óptico.

Técnica

  1. Realizar un frotis bacteriano de la cepa de mycobacterium phlei y fijarla la extensión con calor.
  2. Añadir el primer colorante: Carbofucsina.
  3. Se pasa por el mechero varias veces, durante cinco minutos, sin permitir que hierva el colorante.
  4. Decantar y lavar con agua destilada el exceso de colorante.
  5. Decolorar con alcohol/ácido hasta que la muestra tenga un color rosado.
  6. Lavar con agua destilada.
  7. Teñir con el colorante azul de metileno durante un minuto.
  8. Lavar con agua destilada hasta retirar el excesp de colorante.
  9. Secar la extensión al aire.
  10. Observar al microscopio óptico y anotar los resultados.

Resultados

En la teoría si el microorganismo aparece de color rosa es AAR+ o ácido alcohol resistente positivo. En cambio, si el microorganismo aparece de color azul, en el microscopio óptico, es AAR- o ácido alcohol resistente negativo.

No tengo fotos ni dibujos, porque no conseguimos visualizar la mycobacteria. Ésta debería haber aparecido de color rosa, indicando su positividad frente a la alcohol resistencia.

Observaciones

La mayoría de los grupos obtuvieron el mismo resultado que el nuestro. La mycobacteria no aparecía por ninguna parte. Incluso se realizaron tinciones obteniendo el microorganismo del tubo original (comercial) sobre el que estaba sembrado. Con idéntico resultado.

Un par de grupos sí que consiguieron visualizar débilmente el microorganismo, en muy poca cantidad. Comparamos las técnicas, por si había habido alguna variación, pero todas eran idénticas. Meses después nos ocurrió lo mismo con otro microorganismo (una levadura), que literalmente desapareció del frasco comercial y nos impidió visualizarla en otra técnica. Curiosamente, esa misma levadura, meses antes, no nos dio ningún problema en la tinción negativa de cápsulas.

Se trataba de microorganismos comerciales modificados genéticamente para no representar un riesgo patológico. Solamente pudimos divagar sobre si esa modificación genética tuvo algo que ver en el resultado o si en realidad nuestro desempeño en la técnica no fue el adecuado.

Personalmente, tampoco se me ocurrió sugerir la “resiembra” del microorganismo en algún medio adecuado para comprobar la existencia o no, mediante el crecimiento, del microorganismo. Tampoco volvimos a utilizar este microorganismo en prácticas posteriores que nos hubiesen dado alguna pista sobre lo sucedido.

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