Tinción de Negro Sudán B

La Tinción de Negro Sudán B es una práctica que realicé en la asignatura de hematología clínica. Durante la segunda evaluación del primer curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Tinción de Negro Sudán B

Objetivos

  • Determinar la presencia de fosfolípidos y esteroles en el citoplasma de los leucocitos.
  • Diferenciar las líneas celulares por su positividad o negatividad al Negro Sudán B.

Fundamento

Los métodos citoquímicos son aquellos que determinan la existencia o localización de los diferentes contituyentes químicos de las células. Los compuestos químicos analizados se ponen de manifiesto mediante la visualización de las sustancias coloreadas resultantes de la reacción química producida entre los compuestos que se estudian y los reactivos específicos.

El Negro Sudán B tiñe los fosfolípicos y los esteroles. En los neutrófilos tiñe los gránulos de color gris negruzco. En los leucocitos, la tinción de Negro Sudán B tiene la misma utilidad y resultados que la reacción de las mieloperoxidasas.

Tinción de lípidos: Técnica del Negro Sudán B

Las células de estirpe granulocítica son positivas para la reacción de este colorante. Los componentes celulares del Sistema Mononuclear Fagocítico (SMF) dan resultados variables para esta tinción, ya que los monocitos en sangre periférica se muestran débilmente positivos. Las células de la línea linfoide, eritroide y megacariocítica son negativas.

Esta tinción puede servir para identificar el origen mieloide o linfoide de las células blásticas presentes en la leucemia aguda. La LAM7 (megacariocítica) es la única leucemia mieloblástica aguda cuyos blastos son negativos para el Negro Sudán B.

Material

Reactivos

  • Aceite de inmersión
  • Sangre anticoagulada con EDTA
  • Agua desionizada
  • Formol
  • Reactivo de fenol
  • Colorante Negro Sudán B
  • Etanol al 70%
  • Solución de Giemsa

Técnica

Preparación de la solución extemporánea de colorante y tampón

  • Preparar una solución extemporánea de Colorante (Negro Sudán B) y Tampón (Reactivo de Fenol) en proporción 3:2 (180 ml y 120 ml).
    • Colorante: 0,6 gramos de Negro Sudán B en polvo + 200 ml de etanol absoluto. Se deja 48 horas en agitación, sin que le de la luz, y se filtra. De los 200 ml se cogen 180 ml.
    • Tampón: 100 ml de disolución acuosa de fosfato disódico 0,3% (m/v) + 16 gramos de fenol en 30 ml de etanol absoluto. De los 130 ml se cogen 120 ml.
    • Los datos pueden variar en función de la hidratación del tampón.

Realización de la Tinción de Negro Sudan B

  1. Realizar varias extensiones sanguíneas.
  2. Fijar las extensiones con vapores de formol durante 10 minutos. Para ello hay que hacer una cámara de formol haciendo uso del cristalizador, los capilares y papel de filtro impregnado en algunas gotas de formol. Es importante que los frotis no se pongan en contacto directo con el papel de filtro impregnado en formol. El cristalizador debe taparse una vez se haya dispuesto la cámara.
  3. Lavar las extensiones con agua desionizada.
  4. Incubar las extensiones durante una hora a 37ºC en una mezcla formada por reactivo de fenol y solución de Negro Sudán B a una proporción de 2:3.
  5. Lavar las extensiones con agua desionizada.
  6. Limpiar las extensiones con una solución de etanol al 70% en agua destilada durante 2 o 3 minutos para eliminar el exceso de colorante. Este lavado se realiza introduciendo los frotis en una cubeta de tinción con etanol al 70% y agitando durante unos minutos.
  7. Lavar las extensiones con agua desionizada.
  8. Contrastar durante 20 minutos con solución de Giemsa recién diluída con agua destilada a una proporción de 1:9.
  9. Lavar con agua desionizada y dejar secar al aire.
  10. Observar al microscopio la presencia de precipitados citoplasmáticos de color gris negruzco.

Resultado e interpretación

Tinción de Negro Sudán B
Reactivo de fenol de la casa comercial Panreac.
Tinción de Negro Sudán B
Colorante Sudan III de la casa comercial Panreac. Este colorante fue utilizado por otros grupos que realizaban una práctica paralela.
Tinción de Negro Sudán B
Colorante Negro Sudán B en un vidrio de reloj después de haber pesado la cantidad necesaria para su reconstitución.
Tinción de Negro Sudán B
Filtrando el colorante ayudándonos de un embudo y de papel de filtro.
Tinción de Negro Sudán B
Fijando la extensión sanguínea dentro de una cámara de formol.
Tinción de Negro Sudán B
Cubeta de tinción con solución extemporánea de Negro Sudán B y gradilla de tinción cargada de portaobjetos preparados con sus correspondientes extensiones fijadas.
Tinción de Negro Sudan B
Incubando las extensiones dentro de las soluciones extemporáneas preparadas de Negro Sudán B y Sudan III.
Tinción de Negro Sudán B
Retirando los restos de colorante de las extensiones.
Tinción de Negro Sudán B
Neutrófilos positivos al Negro Sudán B (1000X de resolución al microscopio óptico usando el objetivo de inmersión).
Tinción de Negro Sudán B
Linfocito negativo y Monocito débilmente positivo al Negro Sudán B (1000X de resolución).
Tinción de Negro Sudán B
Mi preparación. Extensión sanguínea fijada con formol y teñida con Negro Sudán B.

Observaciones

Se descartó el uso de la tinción de Giemsa como colorante de contraste. De hecho, no se utilizó ningún colorante para este fin.

Paralelamente, varios grupos utilizaron el colorante Sudán III en una versión alternativa a esta práctica usando este colorante. Es el motivo por el que en algunas imágenes se aprecia la cubeta de dicho colorante (de color rojo) al lado de la cubeta del colorante Negro Sudán B (de color negro).

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