Tinción de Gram

Tinción de Gram

La tinción de gram es una de las primeras prácticas que realicé cuando cursaba microbiología clínica. Ésta es una asignatura que cursé durante el segundo año de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Tinción de Gram

Título

Tinción de Gram.

Objetivos

  • Realizar una tinción de gram sobre una muestra problema.
  • Aprender a diferenciar entre microorganismos gram+ y gram-.

Fundamento

La técnica de la tinción de gram fue ideada y desarrollada por Christan Gram en el año 1884.

Para la realización de una tinción de gram se utilizan dos colorantes. Uno de carácter primario, como es el cristal violeta, y otro de contraste, como la safranina. También se utiliza un mordiente para la safranina, como es el lugol, y un decolorante como el alcohol/acetona.

Esta tinción pone de manifiesto la afinidad tintorial de la pared, la cual depende de su composición para que el microorganismo sea considerado gram+ o gram-.

Los microorganismos grampositivos se diferencian de los gramnegativos en que tienen más mureína, una pared celular monoestratificada y presencia de ácidos teitoicos. Los gram- tienen menos mureína, una pared celular biestratificada y no tienen ácidos teitoicos.

Esta técnica sirve, junto a la morfología, para clasificar las bacterias como:

  • Cocos grampositivos.
  • Bacilos grampositivos.
  • Cocos gramnegativos.
  • Bacilos gramnegativos.

También existen bacterias en forma de espiral, catalogadas dentro de las bacterias gramnegativas, y bacterias con forma de coma o vibrio que se incluyen dentro de los bacilos gramnegativos.

La tinción de gram cuenta con limitaciones, ya que no sirve para clasificar bacterias como mycobacterias y mycoplasmas. Esto es debido a que las mycobacterias están encapsuladas y los mycoplasmas no poseen pared celular.

Pese a su edad, es una técnica que se sigue utilizando hoy en día en los laboratorios de diagnóstico clínico. Los laboratorios de microbiología cuentan, incluso, con aparatos de tinción automática. Tras la realización de un frotis bacteriano a partir de una muestra cultivada, ésta se introduce en el aparato y se realiza la tinción de gram.

Material y reactivos

  • Mecheros bunsen con gas centralizado.
  • Papel de filtro.
  • Portaobjetos.
  • Placas de petri con microorganismos sembrados sobre un medio de cultivo.
  • Asa de siembra de platino.
  • Cubeta con agua.
  • Puentes de tinción.
  • Pipetas pasteur.
  • Agua destilada.
  • Lugol.
  • Alcohol/Acetona 1:1
  • Safranina.
  • Cristal Violeta.
  • Microscopio óptico.

Técnica

  1. Preparar un frotis bacteriano.
  2. Teñir el frotis de cristal violeta durante 1 minuto.
  3. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
  4. Cubrir la preparación con lugol durante 1 minuto.
  5. Se lava con agua destilada hasta eliminar el exceso de lugol.
  6. Lavar con alcohol/acetona la preparación para eliminar el primer colorante.
  7. Lavar de nuevo con agua destilada para retirar los restos de alcohol/acetona.
  8. Teñir la preparación con safranina durante 1 minuto.
  9. Lavar con agua destilada hasta eliminar el exceso de colorante.
  10. Secar la preparación al aire.
  11. Observar al microscopio óptico y finalmente identificar los microorganismos como grampositivos o gramnegativos.

Resultados

Tinción de gramCocos gramnegativos en racimo observados con el objetivo de 40X (Resolución 400X)

Tinción de gramBacilos grampositivos (estreptobacilos) observados con el objetivo de 40X (Resolución 400X)

Interpretación de los resultados

Se realizaron varias extensiones con varios microorganismos diferentes que se clasificaron como gram+ o gram-, distinguiendo, además, su morfología y su agrupamiento.

  • 1 – microorganismo nº1: Bacilo grampositivo en cadenas.
  • 2 – microorganismo nº3: Coco grampositivo en tétradas.
  • 3 – microorganismo nº4: Coco grampositivo en racimos.
  • 4 – microorganismo nº5: Bacilo grampositivo aislado o en parejas.
  • 5 – microorganismo nº6: Bacilo gramnegativo aislado.
  • 6 – microorganismo nº7: Bacilo gramnegativo aislado.
  • 7 – microorganismo nº9: Cocobacilo gramnegativo aislado.

Observaciones

Los grampositivos son muy llamativos a la observación al microscopio. Se ven mucho más claros que los gramnegativos a la hora de identificarlos.

Las extensiones con los bacilos gramnegativos no salieron demasiado bien, ya que solo pudimos intuir que no estaban agrupados. Es decir, parecían estar aislados pero no se podía afirmar con un 100% de certeza.

Tuvimos acceso a 9 cultivos diferentes de microorganismos. No realizamos la tinción de gram a los números 2 y 8 porque se trataba de una levadura y una mycobacteria.

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