Técnicas de Cromatografía

Las técnicas de cromatografía conforman una serie de métodos que permiten el aislamiento, separación, identificación e incluso la cuantificación de componentes presentes en mezclas complejas. Debido a ello, las técnicas de cromatografía son muy utilizadas en el laboratorio.

A lo largo de la entrada veremos los orígenes históricos de estas técnicas y la definición de cromatografía. Y serán la antesala de la clasificación de las técnicas y su explicación una por una.

Definición de Cromatografía

Como siempre hago, vamos a ver qué dice nuestra RAE del término cromatografía:

1. f. Quím. Método de análisis químico para la separación de los componentes de una mezcla por distribución entre dos fases, una estacionaria y otra móvil.
2. f. Quím. Análisis químico realizado mediante cromatografía.

La siguiente definición está extraída de la Wikipedia. Otro lugar fácil donde encontrar definiciones:

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización de mezclas complejas. Tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla. Permitiendo así identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

Buscando alguna buena definición más me topé con un video del Instituto de Química Orgánica General del CSIC muy bueno. A veces vale más una imagen que mil palabras. En este caso un video:

El origen histórico de la Cromatografía

El término cromatografía fue empleado, por primera vez, por el científico ruso Mijaíl Tsvet. Y lo hizo en el año 1906, pese a que llevaba realizando técnicas de cromatografía desde 1903.

Tsvet logró separar una mezcla de pigmentos de plantas, o clorofilas, en una columna de carbonato de calcio. Años más tarde aplicó la cromatografía a un extracto de yema de huevo en una columna de inulina.

Debido a que Tsvet divulgó sus investigaciones en el idioma ruso, haciendo uso de una revista de divulgación con poco alcance, no fue hasta los años 30 cuando otros investigadores tuvieron acceso a sus avances y pudieron retomar el desarrollo de la cromatografía.

A partir de ese momento, y durante los años siguientes, las técnicas de cromatografía comenzaron a desarrollarse. Las mejoras de las técnicas ya existentes y el desarrollo de nuevas técnicas fue continuo:

  • 1931 – Redescubrimiento de la Cromatografía por Kuhn y Lederer.
  • 1941 – Cromatografía de reparto por Martin y Synge.
  • 1944 – Cromatografía de papel por Gordon, Consden y Martin.
  • 1947 – La Comisión de Energía Atómica, de los Estados Unidos, dio a conocer información sobre el uso de la cromatografía de intercambio iónico para la separación de productos de fisión nuclear.
  • 1952 – Cromatografía de gas-líquido por Martin y James.
  • 1956 – Cromatografía de capa fina por Stahl.
  • A partir de 1956 – Gracias a los avances de las nuevas técnicas comienza a desarrollarse la teoría de la separación cromatográfica.
  • 1959 – Cromatografía de filtración en gel por Porath y Flodin.
  • 1960 – Comienza el desarrollo del HPLC.
  • 1962 – Se utiliza por primera vez la Cromatografía de Fluídos Supercríticos.

Técnicas de Cromatografía

Como ya hemos visto, se fundamentan en el transporte de la mezcla problema a través de una fase estacionaria (sólida o líquida) mediante una fase móvil (líquida o gaseosa). La fase móvil fluye sobre, o a través de, la fase estacionaria.

Existen diversas formas de llevar a cabo un proceso cromatográfico. Dependerá de cómo se introduce la muestra a separar y cómo se desplaza por la fase estacionaria. Los métodos más comunes son:

  • Desarrollo
  • Elución
  • Desplazamiento
  • Análisis frontal

El método más utilizado es el de elución. Consiste en colocar la muestra en una capa delgada, en la parte superior de la columna, lecho cromatográfico o fase estacionaria. La fase móvil fluye a través de la fase estacionaria arrastrando los componentes de la muestra. La velocidad de movimiento diferirá de un componente a otro y permitirá la recogida de los componentes en momentos distintos, tal y como se muestra en el video que hemos visto.

Clasificación de las Técnicas de Cromatografía o Técnicas Cromatográficas

Las técnicas de cromatografía se pueden clasificar de diferentes modos. De hecho, según las fuentes que consultemos, encontraremos clasificaciones que no se encuentran en todos los sitios. Vamos a ver algunas de ellas:

Técnicas de Cromatografía según la disposición de la fase estacionaria

  • Cromatografía plana: La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o un papel. Según la naturaleza de la fase estacionaria se clasifican en:
    • Técnica de Cromatografía en papel.
    • Técnica de Cromatografía en capa fina.
  • Cromatografía en columna: La fase estacionaría se sitúa dentro de una columna. Según la naturaleza de la fase móvil se clasifican en:
    • Técnica de Cromatografía de líquidos.
    • T. de Cromatografía de gases.
    • T. de Cromatografía de fluídos supercríticos.

Técnicas de Cromatografía según la naturaleza de la fase estacionaria

  • Fase estacionaria sólida: Cromatografía de adsorción.
  • Fase estacionaria líquida: Cromatografía de partición o de reparto.

Técnicas de Cromatografía según el método de separación

  • T. Cromatografía de adsorción.
  • Cromatografía de reparto.
  • T. Cromatografía de intercambio iónico.
  • T. Cromatografía de exclusión.
  • Cromatografía de afinidad.

Técnicas de Cromatografía especiales

Existen una serie de técnicas cromatográficas calificadas como especiales. Aunque en muchas fuentes figuran dentro de las clasificaciones con la mención de las técnicas y un pequeño resumen (ésto en el mejor de los casos), dichas técnicas no serán tratadas en esta entrada.

Técnicas de cromatografía

Cromatografía de Adsorción

Tomaremos como referencia la clasificación según los métodos de separación. Y en ella la primera técnica cromatográfica que veremos será la cromatografía de adsorción. Tsvet utilizó una forma clásica de esta técnica en 1903 para la separación de pigmentos vegetales.

La separación se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorción de los componentes de la muestra hacia la superficie de un sólido que conforma la fase estacionaria. La fuerza con la que es adsorbido un componente dependerá de la polaridad de los componentes, de la actividad del adsorbente que conforma la fase estacionaria y de la polaridad de la fase móvil.

También se denomina cromatografía de adsorción líquido-sólido o cromatografía líquido-sólido. Esto es debido a que la fase móvil es líquida y la fase estacionaria es sólida. La fase estacionaria está formada por partículas finamente divididas de sílice o de alúmina. En algunas fuentes catalogan -desconozco si erroneamente- la fase móvil como sólida o gaseosa.

El máximo exponente de este tipo de cromatografía es la cromatografía en capa fina. La fase estacionaria de esta técnica es un gel, que puede ser de celulosa, sílica, óxido de aluminio… etc. La siguiente entrada tratará específicamente de una práctica usando esta técnica cromatográfica.

El factor de retardo o factor de retención se calcula de la siguiente manera:

Técnicas de cromatografía

Cromatografía de Reparto

La separación de las sustancias ocurre con una fase estacionaria líquida y una fase móvil líquida. Es decir, una cromatografía líquido-líquido. También puede efectuarse con una fase móvil gaseosa, siendo una cromatografía líquido-gas.

Dentro de las cromatografías de reparto encontramos las siguientes técnicas:

  • Cromatografía en papel
  • Cromatografía de gases
  • HPLC o Cromatografía líquida de alta resolución
  • Cromatografía líquida clásica
  • Cromatografía líquida en fase inversa

Técnica de Cromatografía en papel

Está prácticamente en desuso. Aunque figura en el grupo de técnicas líquido-líquido también se le puede relacionar con la cromatografía de adsorción. El soporte de la fase estacionaria es una tira de papel de celulosa, que tiene los líquidos entre sus fibras.

Dependiendo del grado de retención y la solubilidad de las distintas sustancias, el eluyente los arrastrará a distinta velocidad. El grado de retención o factor de retención se calcula del mismo modo que en la cromatografía de capa fina:

Técnicas de cromatografía

Este tipo de cromatografía puede utilizarse para separación de aminoácidos, resolución de problemas bioquímicos, resolución de problemas químicos y control de purezas en productos alimenticios y farmacéuticos.

Cromatografía de gases

La cromatografía de gases, según la fuente que consultemos, estará mencionada como técnica cromatográfica aparte, como técnica cromatográfica dentro de la cromatografía de reparto o como técnica cromatográfica especial. Sin ir más lejos, en el cuadro adjuntado más arriba, está mencionada fuera de las cinco técnicas de cromatografía según los métodos de separación.

La fase móvil de esta técnica, como su propio nombre indica, es un gas. Resulta útil para la separación de analitos gaseosos o volátiles que no pierden sus características físico-químicas cuando adquieren su condición gaseosa.

Un cromatógrafo de gases está compuesto por:

  • Inyector.
  • Eluyente.
  • Caudalímetro de burbujas.
  • Columna cromatográfica.
  • Detector: Detector de ionización de argón, detector de ionización de llama, detector de conductividad térmica… etc. Existen hasta 25 detectores diferentes utilizables en un cromatógrafo de gases.

Dentro de las utilidades de la cromatografía de gases encontramos el análisis de moléculas orgánicas, ácidos o bases libres, fármacos o ácidos orgánicos en plasma sanguíneo.

HPLC o Cromatografía líquida de alta resolución

También llamada cromatografía líquida de alta eficacia. Se trata de un tipo especial de cromatografía en columna en la que la fase móvil circula a través de ella a unas presiones de hasta 340 atmósferas. Actualmente el HPLC es el tipo de cromatografía más usada y más demandada, debido a una serie de ventajas que no presentan otros tipos de cromatografía:

  • Requiere un pequeño volumen de muestra.
  • Automatización de la introducción de la muestra.
  • Las columnas pueden reutilizarse repetidamente.
  • La detección de las sustancias o analitos puede hacerse con un detector de flujo continuo.
  • Permite separación, identificación y cuantificación de analitos.
  • Es una técnica rápida.

El HPLC se emplea para múltiples procesos analíticos. Separación de compuestos orgánicos semivolátiles, toxicología, bromatología, separación de aminoácidos… etc.

Dentro del HPLC existen variantes diferentes de la técnica. El propio cromatógrafo puede disponer de componentes diferentes:

  • Inyectores.
  • Eluyente:
    • Metanol – tampón fosfato.
    • Agua – metanol.
    • Agua – acetonitrilo.
    • ” – Tetrahidrofurano.
  • Bomba.
  • Columna.
  • Detector:
    • Detector de absorbancia UVA-visible.
    • D. de absorbancia infrarroja.
    • D. de fluorescencia.
    • Espectrómetro de masas.
    • Detector electroquímico.
    • D. radioquímico.
  • Integrador/Registrador.

Cromatografía de intercambio iónico

Este tipo de cromatografía se basa en la afinidad de los iones de la muestra, disuelta en la fase móvil, por los iones de la fase estacionaria. La fuerza de interacción que ocurre entre los iones de la muestra y la fase estacionaria es la fuerza electrostática.

El eluyente que conforma la fase móvil suele ser una solución acuosa tamponada. La carga eléctrica de muestra y fase móvil debe ser la misma, y opuesta a la carga de la fase estacionaria. Ésta fase generalmente es una resina. Los iones de la muestra compiten con los iones de la fase móvil por los sitios iónicos de la fase estacionaria. Los que tengan una atracción electrostática más fuerte estarán más retenidos en la resina y la atravesarán con mayor lentitud.

Según la disposición de las cargas de la muestra y las fases, podemos encontrar dos tipos de técnicas de cromatografía de intercambio iónico:

  • Cromatografía de intercambio aniónico.
  • Cromatografía de intercambio catiónico.

Una cromatografía de intercambio aniónico simple, y muy utilizada, es la obtención de agua desionizada. Se trata de una columna con una resina en su interior que desioniza el agua. La resina se reutiliza y cada determinados ciclos debe regenerarse. La regeneración se realiza haciendo pasar soluciones que contengan el ión móvil original, el cual se deposita en la resina y desaloja los iones captados durante el agotamiento de la misma.

Para la regeneración de estas resinas se suelen utilizar:

  • NaCl para regenerar resinas catiónicas de ácidos fuertes.
  • HCl o H2SO4 para regenerar resinas catiónicas de ácidos fuertes y resinas catiónicas de ácidos débiles.
  • NaOH o NH4OH para regenerar resinas aniónicas de bases fuertes y resinas aniónicas de bases débiles.

Cromatografía de exclusión molecular

También llamada cromatografía de tamizado molecular, de filtración por gel o de penetrabilidad. Separa los componentes de una muestra en función de su peso molecular. La fase móvil es un disolvente, que puede ser acuoso u orgánico en función de la solubilidad de la muestra.

La fase estacionaria es químicamente inerte, pero si la fase móvil es acuosa el gel deberá ser hidrófilo e hincharse en contacto con el agua destilada. En cambio, si la fase móvil es orgánica, la fase estacionaria será un gel hidrófobo que se hinchará absorbiendo el disolvente orgánico.

Debido al tamaño del poro, las moléculas pequeñas quedarán retenidas. En cambio, las moléculas grandes no entrarán en los poros y atravesarán el gel con mayor rapidez.

Los usos de este tipo de cromatografía son varios. Determinación de masas moleculares, separación de proteínas marcadas, y la eliminación de sustancias que interfieren en determinadas mezclas, son algunos de ellos.

Cromatografía de afinidad

Esta técnica, realizada en columna, se usa para separar subclases celulares y obtenerlas en estado puro. Un claro ejemplo sería obtener linfocitos B o linfocitos T a partir de una muestra de sangre periférica.

La fase estacionaria es un adsorbente conocido como ligando. Este adsorbente es capaz de interaccionar de manera bioespecífica con la superficie de las células que se pretenden separar. El eluyente de la fase móvil, por su parte, debe ser un disolvente apropiado para las células que se pretenden separar.

En ocasiones es necesario un tratamiento previo en las células que se pretenden separar. Esto es debido a que el nexo de unión de las células con el ligando está ocupado por otro componente químico. Estos componentes se deben retirar mediante el tratamiento.

Si un determinado antígeno se encuentra ocupado por un anticuerpo, el ligando específico para interaccionar con células que presenten dicho antígeno no podrá retener las células en el interior de la columna. En ese caso sería necesario el tratamiento mencionado en el párrafo anterior.

Cuando la muestra atraviesa la fase estacionaria, el ligando retiene las células buscadas. El resto atravesarán la columna junto con el eluyente. Finalmente, para recoger las células retenidas, hay que forzar su salida con un flujo de eluyente a una concentración mayor. De este modo atravesarán la fase estacionaria permitiendo su obtención.

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