Técnica del Ditiotreitol (DTT)

La Técnica del Ditiotreitol (DTT), también llamada Técnica del DTT, es un procedimiento que se utiliza en el Laboratorio de Inmunohematología de Banco de Sangre en determinadas circunstancias.

¿Qué es el Ditiotreitol o DTT?

El Ditiotreitol, también denominado Reactivo de Cleland, es un potente agente reductor cuyo principal uso es la reducción de enlaces disulfuro entre proteínas. El primero que hizo uso del DTT fue precisamente William Wallace Cleland, un bioquímico cuyo apellido forma parte del nombre alternativo de este reactivo.

El DTT ha acabado formando parte de los reactivos utilizados en un Laboratorio de Banco de Sangre. Actualmente lo suministra, en tubos eppendorf congelados a 0,2M, el Centro Regional de Transfusiones. Se debe conservar a temperatura igual o inferior a -18ºC.

Se está estudiando la preparación de un kit, pero por el momento no hay información nueva de si se va a crear finalmente ni de la fecha de su disponibilidad.

Uso del DTT en el Laboratorio de Banco de Sangre

El Ditiotreitol es un reactivo muy útil que ha comenzado a ser usado en el laboratorio de banco de sangre con pacientes que han iniciado una línea de tratamiento con Daratumumab.

¿Qué es el Daratumumab?

Daratumumab es un fármaco antineoplásico para el tratamiento del Mieloma Múltiple. Es un anticuerpo monoclonal anti-CD38 cuyo objetivo es inhibir el crecimiento tumoral de las células que expresan la proteína CD38.

Daratumumab en Banco de Sangre

Este fármaco, una vez ha sido administrado, causa grandes interferencias en los resultados que puede obtener el Laboratorio de Banco de Sangre. Interfiere en el Escrutinio de Anticuerpos Irregulares (Test de Coombs Indirecto), en el Panel de Identificación de Anticuerpos Irregulares, en el Test de Coombs Directo y en las pruebas cruzadas. El resultado obtenido es una panaglutinación que impide la visualización de un resultado evaluable.

Estrategia de transfusión en pacientes tratados con Daratumumab

Normalmente se realiza un Estudio de Anticuerpos Irregulares (EAI) antes de que el paciente comience la línea de tratamiento. Una vez finalizado el tratamiento, las interferencias persistirán durante los 6 meses posteriores. Para evitar realizar la técnica del DTT en múltiples ocasiones se recurre al fenotipado extendido. Hay que tener en cuenta que la cantidad de reactivo es limitada.

Una vez realizado el fenotipo extendido del paciente, si éste necesita transfundirse, el Laboratorio de Banco de Sangre preparará sangre compatible con dicho fenotipo. Si el fenotipo extendido puede respetarse no será necesario recurrir a la técnica del Ditiotreitol. Pero si no se puede respetar será necesario recurrir al DTT si el paciente vuelve a necesitar una nueva transfusión pasadas 72 horas.

Ante una extrema urgencia que imposibilite buscar sangre con fenotipo extendido idéntico, o que impida la realización de la técnica del DTT, se deberá respetar, al menos, el fenotipo RH-Kell del paciente.

Técnica del Ditiotreitol (DTT)

La finalidad de tratar los hematíes con DTT es la de poder realizar la identificación de anticuerpos irregulares sin interferencias. Es una técnica laboriosa que cuenta con controles para garantizar el buen funcionamiento de la misma.

Como control positivo se utilizan hematíes con un fenotipo concreto del Sistema RH. Éstos deben tener el antígeno E, es decir, deben tener fenotipo E+e+/E+e-. En cambio, para el control negativo recurrimos al Sistema Kell, en concreto al antígeno que da nombre al sistema. El antígeno Kell se desnaturaliza en presencia del DTT, por lo que es ideal para este control. El fenotipo debe ser K+k+/K+k-.

Material y reactivos

  • Viales de Ditiotreitol (DTT) congelado en concentración 0,2 M
  • Tubos de ensayo de vidrio
  • Pipetas pasteur
  • Kit de 3 células para escrutinio de anticuerpos irregulares (EAI) en concentración al 3%
  • Kit de 11 células para identificación de anticuerpos irregulares si fuese necesario
  • Muestra de plasma del paciente
  • Antisueros Anti-E y Anti-K
  • Suero de Coombs
  • Baño termostatado a 37ºC
  • Centrífuga con función de autolavado
  • Suero salino fisiológico (SSF) al 0,9% NaCl bien para lavado manual o bien para la centrífuga con función de lavado

Técnica para Escrutinio de Anticuerpos Irregulares

  1. Descongelar los viales de DTT que sean necesarios. A temperatura ambiente y con una posterior homogeneización.
  2. Buscar hematíes con fenotipo compatible para los controles (E+ para control positivo y K+ para control negativo).
  3. Rotular los siguientes tubos (en caso de pruebas cruzadas se añadiría un tubo por cada Concentrado de Hematíes Filtrados):
    • 1 – Célula 1 del kit de EAI.
    • 2 – Célula 2 del kit de EAI
    • 3 – Célula 3 del mismo kit
    • C+ – Control positivo
    • C- – Control negativo
  4. Añadir a cada tubo 2 gotas de hematíes correspondientes en una dilución al 3%.
  5. Lavar los hematíes de cada tubo con SSF un total de tres veces.
  6. Añadir 8 gotas de DTT a cada tubo (4 gotas del reactivo por cada gota de hematíes).
  7. Homogeneizar e incubar en el baño termostatado (37ºC) durante 30 minutos. Importante homogeneizar suavemente por inversion unas 3 ó 4 veces durante la incubación.
  8. Lavar los hematíes 4 veces con SSF.
  9. Al control positivo añadirle dos gotas de Anti-E.
  10. Al control negativo añadirle dos gotas de Anti-K.
  11. Añadir 2 gotas de plasma del paciente al resto de tubos.
  12. Homogeneizar e incubar durante 15 minutos a 37ºC.
  13. Lavar con SSF un total de tres veces.
  14. Añadir a cada tubo 2 gotas de Suero de Coombs (AGH – Antiglobulina Humana).
  15. Centrifugar y comprobar si existe aglutinación.

Interpretación de los resultados para Escrutinio de Anticuerpos Irregulares

El control positivo y el control negativo deben dar su resultado correspondiente. Si el EAI es negativo significa que el paciente no tiene aloanticuerpos, pero con matices. Si el paciente tiene un Anti-Kell será indetectable con esta técnica debido a la desnaturalización del antígeno Kell en los hemantígenos. No haría falta realizar un panel de identificación, pero sí habría que tomar precauciones en caso de transfusión. Los CHF seleccionados para cruzar deberían tener fenotipo K-.

Si el EAI es positivo habría que realizar la técnica del Ditiotreitol aplicada a un panel de 11 células. Ésto facilitaría la identificación del anticuerpo irregular que se oculta tras las interferencias del fármaco.

Técnica para panel de identificación de Anticuerpos Irregulares

  1. Descongelar los viales de DTT que sean necesarios. A temperatura ambiente y con una posterior homogeneización.
  2. Buscar hematíes con fenotipo compatible para los controles (E+ para control positivo y K+ para control negativo).
  3. Rotular los siguientes tubos (en caso de pruebas cruzadas se añadiría un tubo por cada Concentrado de Hematíes Filtrados):
    • 1 – Célula 1 del panel
    • 2 – Célula 2 del panel
    • 3 – Célula 3 del panel
    • 4 – Célula 4 del panel
    • 5 – Célula 5 del panel
    • 6 – Célula 6 del panel
    • 7 – Célula 7 del panel
    • 8 – Célula 8 del panel
    • 9 – Célula 9 del panel
    • 10 – Célula 10 del panel
    • 11 – Célula 11 del panel
    • C+ – Control positivo
    • C- – Control negativo
  4. Añadir a cada tubo 2 gotas de hematíes correspondientes en una dilución al 3%.
  5. Lavar los hematíes de cada tubo con SSF un total de tres veces.
  6. Añadir 8 gotas de DTT a cada tubo (4 gotas del reactivo por cada gota de hematíes).
  7. Homogeneizar e incubar en el baño termostatado (37ºC) durante 30 minutos. Importante homogeneizar suavemente por inversion unas 3 ó 4 veces durante la incubación.
  8. Lavar los hematíes 4 veces con SSF.
  9. Al control positivo añadirle dos gotas de Anti-E.
  10. Al control negativo añadirle dos gotas de Anti-K.
  11. Añadir 2 gotas de plasma del paciente al resto de tubos.
  12. Homogeneizar e incubar durante 15 minutos a 37ºC.
  13. Lavar con SSF un total de tres veces.
  14. Añadir a cada tubo 2 gotas de Suero de Coombs (AGH – Antiglobulina Humana).
  15. Centrifugar y comprobar si existe aglutinación.

Interpretación de los resultados para panel de identificación de Anticuerpos Irregulares

El control positivo y el control negativo deben dar su resultado correspondiente. Si se identifica el aloanticuerpo se deberá respetar fenotipo RH-Kell y el antígeno correspondiente a ese anticuerpo en caso de transfusión. Al respetar el fenotipo RH-Kell queda salvada la situación de un posible Anti-Kell.

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