Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

La práctica separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina es una práctica que realicé en la asignatura de Bioquímica. Esta práctica viene a complementar la temática de las técnicas de cromatografía.

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

Título

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

Objetivo

Realizar una cromatografía de capa fina sobre una muestra problema compuesta de varios aminoácidos.

Fundamentos

Una cromatografía es un método físico de separación de mezclas complejas. Tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla. Permitiendo así identificar y determinar las cantidades de dichos componentes.

La cromatografía en capa fina es el máximo exponente de la cromatografía de adsorción. La fase estacionaria de esta técnica es un gel, que puede ser de celulosa, sílica, óxido de aluminio… etc. La separación se basa fundamentalmente en las distintas afinidades de adsorción de los componentes de la muestra hacia la superficie de un sólido que conforma la fase estacionaria. La fuerza con la que es adsorbido un componente dependerá de la polaridad de los componentes, de la actividad del adsorbente que conforma la fase estacionaria y de la polaridad de la fase móvil.

En cuanto al uso en bioquímica clínica, los aminoácidos presentes en la orina de una forma anómala pueden ser separados y detectados mediante una cromatografía de capa fina. Debido a la diferente intensidad con la que interaccionan con un material adsorbente presente en la fase fija.

Material y reactivos

  • Láminas de gel de celulosa de 20×20 cm (fase estacionaria o fase fija)
  • Tarro de cristal
  • Micropipeta de 2 microlitros
  • Pulverizador
  • Lápiz
  • Tijeras
  • Regla
  • Patrón de Leucina a una concentración de 0.8 mg/ml
  • Patrón de Alanina a una concentración de 0.8 mg/ml
  • ” de Glicina a una concentración de 0.8 mg/ml
  • Muestra de aminoácidos (Leu + Ala + Gly) que incorpora el kit

Técnica

  1. Verter el eluyente en la cubeta, de forma que cubra el fondo de ésta hasta una altura máxima de 1cm.
  2. Tapar el tarro.
  3. Con un lápiz muy blando, para no dañar el gel, marcar los límites de la placa de fase fija que se va a utilizar (5x10cm).
  4. Cortar las láminas, con unas tijeras, con cuidado de no estropear el gel.
  5. Con el lápiz marcar los puntos donde se depositarán las muestras.
  6. Con la placa en posición horizontal aplicar 2µl de la muestra y de los patrones.
  7. Una vez que todos los puntos de aplicación se han secado al aire, introducir la placa verticalmente en el tarro, de forma que aquellos queden en la base de éste.
  8. Volver a tapar el tarro.
  9. Dejar que el eluyente suba por capilaridad durante una hora aproximadamente.
  10. Cuando el frente del eluyente haya subido unos 8 cm, sacar la placa del tarro.
  11. Marcar con lápiz la línea más alta que ha alcanzado el eluyente.
  12. Secar la placa al aire.
  13. Con la placa perfectamente seca y en posición vertical, pulverizarla con el revelador.
  14. Calentar la placa en una estufa durante unos minutos o dejarla a temperatura ambiente durante más tiempo.

Resultados

Los resultados de la técnica serán presentados en forma de imagen, aunque habrá resultados y cálculos que habrá que presentar en formato texto.

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

En la primera imagen podemos observar la preparación del material. Se corresponde con los primeros pasos de la técnica.

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

La segunda imagen pone de manifiesto la aplicación de la muestra y los patrones en la tira de gel de celulosa.

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

En esta imagen se aprecia como el eluyente (fase móvil) va ascendiendo por adsorción a través del gel de celulosa (fase estacionaria).

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

Una vez que el eluyente ha alcanzado la zona que queríamos, sacamos la tira de gel de celulosa y le aplicamos la solución reveladora haciendo uso de un pulverizador.

Separación de aminoácidos con cromatografía en capa fina

En esta imagen apreciamos el resultado final de la cromatografía en capa fina. De izquierda a derecha tenemos: Muestra, Patrón 1, Patrón 2 y Patrón 3. Las mediciones obtenidas fueron las siguientes:

  • Distancia recorrida por el Eluyente: 6.5 cm
  • Distancia recorrida por el Patrón 1: 1.2 cm
  • ” recorrida por el Patrón 2: 3.9 cm
  • ” recorrida por el Patrón 3: 1.8 cm

Ahora hay que aplicar la fórmula del factor de retención:

Técnicas de cromatografía

Y obtenemos los siguientes resultados:

  • Rt del Patrón 1 = 0.18
  • Rt del Patrón 2 = 0.6
  • ” del Patrón 3 = 0.28

Interpretación de los resultados

Los patrones utilizados en esta práctica tenían los siguientes factores de retención (Rt)

  • Rt de la leucina = 0.66
  • ” de la alanina = 0.29
  • ” de la glicina = 0.18

Por tanto, comparando los valores conocidos de los patrones con los valores obtenidos de los aminoácidos de la sustancia problema podemos afirmar que el Patrón 1 se corresponde con la Glicina. También que el Patrón 2 se corresponde con la Leucina. Y finalmente el Patrón 3 se corresponde con la Alanina.

Observaciones

Realizamos la práctica “a ciegas”, es decir, con los patrones, sus concentraciones y el Rt de cada uno de ellos, pero sin saber cuál era cada uno de los que aplicábamos, así que nuestro objetivo real era realizar la cromatografía de manera correcta y averiguar, mediante los factores de retención obtenidos, que sustancia se correspondía con el aminoácido patrón en cuestión.

La muestra finalmente tuvo un papel meramente de control. Nos sirvió para comparar que la cromatografía se realizaba con éxito, ya que cada aminoácido, como se puede apreciar en la imagen, avanzó por el soporte exactamente igual que su homólogo.

Durante la realización de la técnica, los puntos de aplicación los pusimos a 2 cm del borde en lugar de a 1 cm, ya que echamos en el bote del cristal más eluyente del debido, y de este modo impedimos que la muestra y los patrones estuviesen en contacto directo con el eluyente.

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