Electroforesis

A lo largo de esta entrada vamos a ver en profundidad una de las técnicas de separación de moléculas que se emplean en el laboratorio clínico y biomédico: la electroforesis. Dentro de las técnicas de separación, anteriormente, pudimos ver las técnicas de cromatografía y el uso práctico de la centrifugación.

Definición de electroforesis

La electroforesis es definida de la siguiente manera por la Real Academia de la lengua Española:

Del fr. électrophorèse, y este de électro- ‘electro-‘ y el gr. φόρησις phórēsis ‘transporte’.
1. f. Quím. Desplazamiento de sustancias por la acción de un campo eléctrico.
2. f. Quím. Técnica de separación de sustancias basada en el fenómeno de la electroforesis.

En Wikipedia encontramos la siguiente definición de electroforesis:

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según la movilidad de éstas en un campo eléctrico.

Finalmente, podemos definir la electroforesis de una manera más completa:

La electroforesis es una técnica analítica de separación de moléculas en función de su carga eléctrica neta. Se entiende por carga eléctrica neta de una molécula a la suma de las cargas, positivas y negativas, de sus grupos ionizables.

Fundamentos de la electroforesis

Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio con moléculas cargadas, éstas se desplazarán hacia los electrodos en función de su carga. Las moléculas cargadas negativamente, aniones, se desplazan hacia el electrodo positivo, el ánodo. Por otra parte, las moléculas cargadas positivamente, cationes, se desplazan hacia el electrodo negativo, el cátodo.

ElectroforesisRepresentación del movimiento de cargas

En un sistema electroforético actúan dos fuerzas opuestas sobre cada una de las moléculas cargadas. Una de ellas es la fuerza debida al campo eléctrico que se le aplica al sistema. La otra es la fuerza de resistencia que ejerce el medio sobre la molécula.

La resultante de ambas fuerzas determinará el movimiento de la molécula, a una velocidad constante. La velocidad es directamente proporcional a la carga de la molécula e inversamente proporcional a su tamaño y a la viscosidad del medio.

Factores que afectan a la electroforesis

Existen una serie de factores que afectan a la movilidad electroforética.

  • Flujo electroosmótico: Puede influir en la movilidad electroforética, dependiendo del soporte utilizado. El flujo electroosmótico tiene una influencia alta si el soporte es de papel de filtro. Pero es despreciable si el soporte utilizado es un gel de poliacrilamida.
  • Difusión: La extensión de la muestra sobre el soporte puede afectar a la resolución de la separación. Puede suceder con facilidad en muestras donde se pretenden separar moléculas de pequeño tamaño, como los aminoácidos. El resultado puede venir dado con zonas superpuestas de separación.
  • Adsorción: También llamado coeficiente de fricción en algunas fuentes. Según el material del soporte, el poder de adsorción variará y modificará el poder de separación de las moléculas. También tienen mucho que decir el tamaño de las moléculas y la viscosidad del disolvente.
  • Temperatura: La corriente eléctrica aplicada al sistema electroforético aumenta la temperatura. Con el aumento de temperatura se produce una evaporación que aumenta la concentración de las moléculas en la solución tampón. Esta concatenación no termina ahí, ya que al aumentar la concentración del electrolito aumenta, por ende, la conductividad del medio, disminuyendo la movilidad electroforética. Además, un exceso de temperatura puede suponer la desnaturalización protéica de la muestra.
  • Otros factores: También influyen otros factores como el voltaje aplicado, el tipo de tampón utilizado o el tiempo de duración de la electroforesis.

Material necesario para realizar una electroforesis

  • Cubeta electroforética

    Es el recipiente donde se lleva a cabo la técnica electroforética. Consta de dos cavidades separadas, donde se localizan los electrodos y en las que se vierte la solución tampón. Según el diseño y la temperatura que pueda alcanzar el sistema durante la electroforesis, la cubeta puede tener una tapa. Además, está conectada a la fuente de alimentación mediante dos cables. Un cable negro para el cátodo y un cable rojo para el ánodo.

    En su interior se sitúa el puente en el que se aloja el soporte. Dicho puente consta de un diseño preparado para que el soporte mantenga una extensión óptima gracias a una especie de pinzas.

  • Fuente de alimentación

    Proporciona la corriente eléctrica necesaria, transformando la corriente alterna de la red eléctrica en corriente contínua. Permite la regulación del voltaje para crear la diferencia de potencial óptima y deseada en la cubeta electroforética.

  • Soporte

    Es el medio físico en el que ocurre la separación de moléculas. Pueden ser de dos tipos. Por una parte están los Soportes de clase I o No restrictivos, que permiten la separación molecular según la carga eléctrica neta de las moléculas. Pueden ser de papel de filtro o de cellogel (acetato de celulosa).

    Por otro lado tenemos los Soportes de clase II o Restrictivos, que permiten la separación molecular según la carga eléctrica neta y el tamaño de las moléculas. Pueden ser de gel de almidón, gel de agarosa o gel de poliacrilamida.

    El llamado soporte ideal debe ser químicamente inerte, sin grupos ionizables, consistente, homogéneo, estable y barato

electroforesis

  • Solución tampón

    Es una solución amortiguadora o buffer. Ajusta el medio al pH más adecuado para que se ionicen las moléculas que se pretenden separar. Estas soluciones tampón permiten que se mantenga el pH constante en todo momento. De este modo la carga eléctrica también se mantendrá constante durante la electroforesis.

  • Aplicador

    Es un dispositivo ideal para depositar la muestra sobre el soporte en forma de banda. Esta banda puede ser de diversos tamaños según el aplicador que utilicemos (macro, semimicro o micro). En la actualidad existen aplicadores múltiples que permiten depositar varias muestras a la vez.

  • Colorante

    Son sustancias químicas cuya función es evidenciar las bandas obtenidas durante la electroforesis. El colorante utilizado dependerá de la naturaleza de las sustancias que se pretenden teñir. Por ejemplo, en electroforesis de hemoglobinas o de proteínas séricas se utilizan el Negro Amido o el Rojo Ponceau como colorantes. En el caso de una electroforesis de lipoproteínas el colorante más indicado es el Negro Sudán B.

Métodos de detección y cuantificación de una electroforesis

Existen diversas formas de detección y cuantificación de los resultados de la electroforesis.

  • Espectrofotometría: Se cortan por separado las bandas obtenidas tras la electroforesis. Se deposita cada una de ellas en un tubo de ensayo, añadiendo después un disolvente. Una vez disuelta la banda recortada, se mide su absorbancia en un espectrofotómetro y se suma el resultado al del resto de bandas. La suma de las absorbancias establecerá el 100% de la muestra. Comparando porcentualmente los resultados, de manera individual, conseguiremos los porcentajes de cada molécula representada en cada una de las bandas.
  • Fotodensitometría: Este método requiere de un transparentado del soporte, y una posterior medición de las bandas mediante un fotodensitómetro.
  • Fluorescencia: Se utilizan fluorocromos para manifestar las bandas y poder cuantificarlas. Son muy utilizados el Bromuro de Etidio, que es altamente tóxico, y los compuestos GelRed y GelGreen.
  • Métodos radiológicos: Se utilizan isótopos radiactivos para marcar las moléculas que pretendemos detectar y medir. Una vez realizada la electroforesis se mide la emisión radiactiva de los isótopos.
  • Métodos enzimáticos: Fundamento similar al método radioquímico, pero utilizando enzimas. Se detecta la actividad enzimática.
  • Métodos inmunológicos: También llamado inmunoelectroforesis. Se utiliza la precipitación de los complejos antígeno-anticuerpo. Se utilizan anticuerpos que van a reaccionar con los antígenos (proteínas) buscados. Dentro de este método existen distintas variantes según el tipo de soporte y el tipo de técnica electroforética que utilicemos.

Técnicas de electroforesis

Antes de entrar en técnicas electroforéticas concretas conviene que las clasifiquemos según el tipo de técnica empleada.

  • Electroforesis de zona: Las proteínas son moléculas anfóteras, capaces de comportarse como un ácido y como una base. La carga neta que adquieran las proteínas dependerá del pH del medio. Normalmente el medio es alcalino, pero también se puede realizar una electroforesis utilizando un medio ácido. Si se utiliza un medio ácido hay que tener cuidado de que no sea demasiado ácido, con un pH demasiado bajo, ya que las proteínas precipitarían. Los soportes que se utilizan para electroforesis de zona son:
    • Papel de filtro.
    • Cellogel.
    • Agarosa.
    • Poliacrilamida.
    • Capilar de sílica fundida.
  • Isoelectroenfoque: Se verá en detalle individualmente.
  • Electroforesis con soporte tamizado: Es ideal para separación de proteínas y ácidos nucléicos. Permite la separación de las moléculas por tamaño. Los soportes son tamizados y permiten que las moléculas pequeñas se desplacen más fácilmente que las grandes. Se podrían mencionar dos ejemplos electroforéticos de seperación de ácidos nucléicos y proteínas. El gel de agarosa se emplearía en el primero, y el gel de poliacrilamida con SDS y mercaptoetanol en el segundo. Los ácidos nucléicos migrarían del negativo al positivo debido a las cargas negativas del esqueleto de azúcar fosfato. Las proteínas serían cargadas negativamente por el SDS y los puentes disulfuro se romperían con la acción del mercaptoetanol, desnaturalizando las proteínas.

Electroforesis en papel de filtro y en acetato de celulosa

La técnica electroforética con papel de filtro como soporte se usa muy poco, y su uso queda reducido a la separación de aminoácidos.

En cambio, la electroforesis en acetato de celulosa, o cellogel, tiene una serie de ventajas respecto al papel de filtro. Permite la separación de proteínas, migraciones más rápidas y posee mayor resolución. En el futuro se publicarán dos prácticas de electroforesis de proteínas con acetato de celulosa como soporte.

Electroforesis en gel de agarosa

El gel de agarosa es un buen soporte electroforético. En su carta de presentación figuran los pocos problemas de electroósmosis y de adsorción que posee. Pero, además, su naturaleza le otorga la característica de poder separar las moléculas en función de su tamaño.

Este gel está constituído por una matriz tridimensional de fibras poliméricas. La matriz, que retarda el paso de las moléculas, figura embebida en una gran cantidad de líquido.

Como hemos visto anteriormente, este soporte permite separar ácidos nucléicos en función de su tamaño. Se utiliza para separar moléculas grandes del tamaño del orden de 20 Kilonucleóticos.

Electroforesis en gel de poliacrilamida

El gel de poliacrilamida está considerado como el mejor soporte. Plantea una vuelta de tuerca más a las prestaciones ofrecidas por el gel de agarosa, ya que no presenta casi electroósmosis ni adsorción. Son geles transparentes químicamente inertes, uniformes y de preparación rápida. Además poseen una gran estabilidad mecánica y son insolubles en agua. Entre tanta ventaja surge un inconveniente que está limitando su uso: es neurotóxico.

Se utiliza para la separación de proteínas y, al igual que el gel de agarosa, permite la separación de las moléculas en función de su tamaño. El tamaño del poro es modificable en su creación variando la concentración de polímeros de acrilamida. Las bandas resultantes se revelan con el colorante Azul de Coomassie.

Electroforesis capilar

Esta técnica difiere bastante de las anteriores. El soporte es distinto, ya que utiliza capilares de sílica fundida cubiertos con una capa de polimina. También lo es la detección y cuantificación, ya que corre a cargo de detectores específicos, que pueden ser de luz ultravioleta, de fluorescencia, un espectrómetro de masas…

La visualización de los resultados se hace a través de la pantalla de un ordenador. Los detectores transmiten la información directamente al ordenador para ser tratada adecuadamente con un software específico. El resultado es la visualización de un electroferograma.

La electroforesis capilar posee una serie de ventajas muy interesantes. La cantidad de muestra y reactivos necesarios es menor que en otras técnicas. También es menor el tiempo de análisis requerido para la obtención de resultados. Otro aspecto destacable es la versatilidad que le confiere la posibilidad de utilizar diferentes detectores, ampliando la capacidad de separación de moléculas diferentes.

Es una técnica versátil, eficiente y económica, que permite la separación simultánea de distintas moléculas utilizando cantitades pequeñas de muestras y reactivos.

Isoelectroenfoque

El isoelectroenfoque cuenta con una diferencia fundamental respecto al resto de electroforesis vistas hasta ahora. La separación de las moléculas viene determinada por la acción de un campo eléctrico y de un gradiente de pH.

El gradiente de pH se crea con el empleo de una solución tampón constituida con anfolitos, que son sustancias que crean un gradiente de pH decreciente desde el cátodo hasta el ánodo. El anfolito utilizado en el extremo anódico es el ácido ortofosfórico. Mientras que el anfolito utilizado en el extremo catódico es el ácido acético.

Una vez creadas las condiciones del gradiente, las moléculas se movilizan bajo la acción del campo eléctrico. Se desplazan a lo largo del soporte hasta que alcanzan la zona en la que el pH es igual a su punto isoeléctrico. En ese momento su carga neta se convierte en nula y la molécula deja de desplazarse.

La principal ventaja de esta técnica es su resolución, ya que incrementa la capacidad de separación de las moléculas respecto a las técnicas electroforéticas de zona. En cambio, su principal inconveniente es la temperatura, ya que el sistema necesita voltajes muy altos, incrementando la temperatura del sistema y haciendo necesaria la aplicación de un sistema de refrigeración.

Electroforesis bidimensional

La electroforesis bidimensional es una técnica resultante de la combinación de un isoelectroenfoque y una electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS PAGE). Los campos eléctricos utilizados son perpendiculares, formalizando las dos dimensiones de la técnica.

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Dicha combinación no es simultánea. Primero se realiza la técnica de isoelectroenfoque, y sobre el resultado de ella se realiza la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS.

En definitiva, la electroforesis bidimensional es una técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas muy complejas de proteínas.

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