Electroforesis de proteínas séricas

La Electroforesis de proteínas séricas es una práctica que realicé en la asignatura de bioquímica clínica. Durante el segundo año de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Electroforesis de proteínas séricas

Objetivo

Realizar una electroforesis de proteínas séricas presentes en una muestra sanguínea problema.

Fundamento

Las proteínas son moléculas anfóteras, es decir, pueden estar cargadas de forma positiva, negativa o no estarlo. Su carga depende del pH del medio en el que se encuentren. Cuando el pH del medio que circunda las proteínas es neutro, éstas se comportan como partículas no cargadas. Sin embargo, si el pH del medio que les rodea es ácido, las proteínas adquieren una carga eléctrica neta positiva. Por el contrario, cuando el pH es básico las proteínas se cargan negativamente.

En la electroforesis de proteínas séricas, el suero se deposita sobre un soporte empapado por una solución alcalina y se aplica una corriente eléctrica que lo atraviesa.

Como las proteínas en medio básico adquieren una carga eléctrica negativa, éstas se van desplazando progresivamente hacia el ánodo. A este proceso se le llama migración de las proteínas.

En el suero hay una gran variedad de proteínas y cada una de ellas adquiere la carga eléctrica negativa de una forma más o menos intensa. Así pues, las más electronegativas avanzan más rápidamente hacia el ánodo y las menos electronegativas lo hacen más lentamente.

Al cabo de un cierto tiempo, las proteínas se agrupan atendiendo a su electronegatividad y, por lo tanto, a su capacidad de migración. Estas agrupaciones proteicas adoptan un aspecto de bandas y reciben el nombre de fracciones.

Electroforesis de proteínas séricas

Si se deja transcurrir la corriente eléctrica durante un tiempo suficiente, se distinguen varias bandas separadas unas de otras como consecuencia de su diferente capacidad de migración.

Cuando el soporte utilizado para la electroforesis de proteínas séricas es una tira de acetato de celulosa, en el suero normal se encuentran cinco fracciones proteicas, las cuáles, ordenadas de mayor a menor movilidad electroforética, son las siguientes:

  • Albúmina
  • α1 globulinas
  • α2 globulinas
  • β globulinas
  • γ globulinas

Si la muestra es plasma se distingue una fracción más que corresponde al fibrinógeno y que se sitúa entre las β globulinas y las γ globulinas.

La albúmina es una especie molecular simple, pero cada fracción globulínica está formada, a su vez, por numerosas proteínas, cuya separación se realiza por técnicas más específicas. Un claro ejemplo de esto sería la cuantificación de α2 macroglobulina (una de las proteínas pertenecientes a la fracción de las α2 globulinas), en una muestra problema, mediante Inmunodifusión Radial (IDR).

Material y reactivos

  • Soporte de electroforesis: Tiras de acetato de celulosa
  • Aplicador semi-micro
  • Cubeta de electroforesis con pinzas
  • Fuente de alimentación
  • Cables de conexión entre la fuente de alimentación y la cubeta de electroforesis
  • Fotodensitómetro
  • Papel de filtro
  • Cuatro bateas
  • Pinzas
  • Placa de vidrio
  • Vidrio de reloj
  • Estufa
  • Tampón Tris-Hipurato a pH 8.8
  • Colorante Negro Amido
  • Decolorante de Negro Amido
  • Solución decolorante y transparentadora
  • Solución transparentadora
  • Muestra de suero sanguíneo
  • Muestra de plasma sanguíneo

Técnica

La técnica es extensa, así que se dividirá en tres subapartados, pero bien podría representarse en uno solo.

Preparación de la electroforesis de proteínas séricas

  1. Sumergir las tiras de acetato de celulosa en un exceso de solución tampón durante 15 minutos.
  2. Absorber el exceso de tampón de las tiras, situándolas entre dos hojas de papel de filtro.
  3. Verter, dentro de la cubeta electroforética, la cantidad de tampón suficiente para que los electrodos queden cubiertos.
  4. Montar las tiras sobre el puente de la cubeta.
  5. Fijar las tiras al puente mediante las pinzas.
  6. Introducir el puente con las tiras en la cubeta, de modo que los extremos de las tiras queden sumergidas en el tampón.

Ejecución de la electroforesis de proteínas séricas

  1. Situar el suero del paciente mediante el aplicador sobre el extremo más cercano al cátodo de cada una de las tiras, a un cm de su borde libre. El aplicador se carga tocando suavemente una gota de muestra dispuesta sobre un vidrio de reloj.
  2. Conectar la cubeta a la fuente de alimentación, usando el cable negro para el cátodo y el rojo para el ánodo. De esta manera, se hace atravesar la corriente eléctrica desde el extremo catódico de las tiras hasta su extremo anódico.
  3. Tapar la cubeta y conectar la fuente de alimentación a la red eléctrica.
  4. Aplicar mediante la fuente de alimentación una corriente eléctrica de 200V durante 30-35 minutos.
  5. Transcurrido el tiempo desconectar la fuente de alimentación de la corriente eléctrica y de la cubeta electroforética.
  6. Soltar las tiras del puente.

Lectura de la electroforesis de proteínas séricas

  1. Colorear las tiras sumergiéndolas en una batea con colorante Negro Amido durante cinco minutos.
  2. Retirar el colorante de las tiras, excepto en los lugares donde éste se ha fijado a las proteínas. Esto se realiza mediante baños sucesivos de las tiras en el decolorante bajo agitación, hasta que se pongan de manifiesto claramente las bandas de proteínas y el fondo sea blanco.
  3. Sumergir la tira en una mezcla de soluciones transparentadoras preparada recientemente (antes de 10 días). Ésto se debe hacer bajo agitación y durante uno o dos minutos.
  4. Extender la tira sobre una placa de vidrio, de forma que su cara absorbente quede en contacto con el cristal. Hay que hacerlo procurando que no se formen burbujas de aire.
  5. Calentar la placa de vidrio en una estufa ajustada a una temperatura entre 60ºC-70ºC durante tres o cuatro minutos.
  6. Dejar enfriar la tira a temperatura ambiente durante unos 30 minutos.
  7. Retirar la tira del vidrio.
  8. Recortarla de tal manera que las bandas puedan ser leídas en el fotodensitómetro.
  9. Realizar la lectura con el fotodensitómetro y anotar los resultados.

Resultado

Electroforesis de proteinas séricas
Reconstitución del tampón Tris-Hipurato.
Electroforesis de proteínas séricas
Solución decolorante y transparentadora de la casa comercial Spinreact.
Electroforesis de proteinas séricas
Solución transparentadora utilizada en la última cubeta de cara a la lectura en el fotodensitómetro.
Electroforesis de proteinas séricas
Todo listo para comenzar la electroforesis de proteinas séricas.
Electroforesis de proteinas séricas
Lectura del fotodensitómetro tras la electroforesis de proteínas séricas presentes en una muestra de suero sanguíneo.

El resultado obtenido no fue el deseado y tampoco pudimos obtener un resultado procedente del espectrofotómetro (ver observaciones). Por tanto se realizó la simulación de un resultado en la siguiente tabla, tomando como concentración normal de referencia en la muestra un valor de 7 g/dl de proteínas séricas.

Electroforesis de proteínas séricas

De este modo se pudo trabajar en base a resultados procedentes de un espectrofotómetro, aunque éstos fuesen ficticios.

Interpretación de los resultados

Los porcentajes normales que representan cada una de las fracciones con respecto al valor total de las proteínas contenidas en el suero son, aproximadamente, los siguientes:

  • Albúmina: 61% +/-4
  • α1 globulinas: 2,5% +/-1,5
  • α2 globulinas: 8,0% +/-2
  • β globulinas: 10% +/-2
  • γ globulinas: 16% +/-3,5

Tomando en consideración los valores normales y comparándolos con los resultados “obtenidos”, previamente representados en la tabla, comprobamos que todos los valores son normales a excepción de las α2 globulinas que están ligeramente aumentadas.

Observaciones

En primera instancia se preparó mal la solución decolorante, echando mucha más cantidad de lo normal de ácido acético (se empleó ácido acético glacial). El resultado fue la total disolución de las tiras de acetato de celulosa en el decolorante.

El espectrofotómetro no funcionó y por tanto se eliminó de la técnica el recorte y disolución de las bandas en tubos con ácido acético. Este era un paso previo a la lectura, que se debía haber realizado en el aparato en cuestión, a 620 nm de longitud de onda.

Tampoco funcionó correctamente la solución transparentadora, ya que las tiras no se conseguían transparentar del todo. Esto provocó lecturas dispares en el fotodensitómetro, tanto de las muestras de plasma como de suero, y la única que se transparentó medianamente bien fue la que nos otorgó un resultado “más normal” (ver imagen en los resultados).

La sensación final fue de impotencia general. Pese a que el error inicial de la solución decolorante fue un error humano, se desconocen las causas de por qué el espectrofotómetro no encendía. También se desconocen las causas del mal funcionamiento de la solución transparentadora, que se realizó con extremo cuidado principalmente por el error cometido al principio de la práctica.

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