Electroforesis de hemoglobina

La Electroforesis de hemoglobina es una práctica que realicé en la asignatura de hematología. Durante el primer curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Electroforesis de hemoglobina

Objetivo

Realizar una electroforesis de hemoglobina a partir de una muestra sanguínea problema.

Fundamento

Las diferentes hemoglobinas tienen distintas cargas eléctricas. Ésto permite separarlas sobre un soporte de acetato de celulosa en un medio alcalino sometido a un campo eléctrico.

Las hemoglobinas más electronegativas migran con más rapidez hacia el ánodo. Como resultado de la electroforesis, aparecen bandas por cada tipo de hemoglobina en el soporte de acetato de celulosa. Una vez que se han separado las bandas, éstas se tiñen con un colorante que permita la visualización de las distintas hemoglobinas.

Cuando se aplica un campo eléctrico a un medio que contiene partículas cargadas, las negativas migrarán hacia el polo positivo, o ánodo, y las positivas migrarán hacia el polo negativo, o cátodo.

La velocidad de migración depende del voltaje aplicado, de la naturaleza del medio en que se desarrolla (tampón) y de todos los aspectos relacionados con la partícula. Si controlamos las condiciones de la electroforesis (pH, temperatura, voltaje y tiempo) podemos reproducir los resultados y comparar.

Electroforesis de hemoglobina

El resultado de la electroforesis se puede interpretar cualitativa y cuantitativamente. De forma cualitativa se realiza observando las distintas bandas teñidas y comparándolas con un patrón. De forma cuantitativa mediante espectrofotometría y densitometría.

Para la cuantificación espectrofotométrica se requiere de la elución de las bandas previo recorte de las mismas. En la cuantificación densitométrica se necesita la transparentación del soporte de acetato de celulosa.

Material y reactivos

• Sangre anticoagulada con EDTA
• Pipetas pasteur
• Tubos de ensayo
• Pipetas de 10, 5, 2, 1 y 0,5 ml
• Pera prepipetera
• Probeta de 100 ml
• Bateas de plástico
• Pinzas de disección
• Tiras de acetato de celulosa
• Aplicador de muestra
• Reloj con alarma
• Cubeta electroforética
• Fuente de alimentación
• Placa lisa de vidrio
• Estufa
• Espectrofotómetro o fotocolorímetro
• Cubetas de espectrofotómetro
• Vidrio de reloj
• Centrífuga
• Vortex
• Suero salino fisiológico 0,9% de NaCl
• Cloroformo
• Reactivo de Drabkin
• Solución tampón tris-glicina o glicocola a pH 8,6
• Solución colorante Negro Amido (0,5 gramos de colorante en 45 ml de metanol y 10 ml de ácido acético glacial)
• Decolorante de Negro Amido (47,5 ml de metanol, 47,5 ml de agua destilada y 5 ml de ácido acético glacial)
• Solución disolvente (Ácido acético al 80% v/v y solución transparentadora A y B en proporción 9:1)
• Metanol absoluto
• Ácido acético glacial
• Solución eluyente, mezcla de ácido acético al 80% y acetona a partes iguales

Técnica

La electroforesis de hemoglobina se realiza en cuatro pasos:

• Preparación del hemolizado
• Electroforesis
• Coloración y decoloración
• Procesamiento de la tira para lectura espectrofotométrica y densitométrica

Preparación del hemolizado

1. Centrifugar la sangre anticoagulada durante 5 minutos a 3000 rpm.
2. Retirar el plasma y trasvasar los hematíes a un tubo de ensayo.
3. Lavar los hematíes 3 veces.
4. Mezclar en tubo de vidrio 0,5 ml de hematíes lavados, 0,75 ml de agua destilada y 0,25 ml de cloroformo. El tubo debe ser de vidrio porque el cloroformo deshace el plástico.
5. Agitar fuertemente el contenido del tubo o hacer uso de un vortex.
6. Una vez rotos los hematíes, centrifugar el tubo y rescatar el sobrenadante con el hemolizado.
7. Determinar la concentración de hemoglobina del hemolizado haciendo uso del método de la cianmetahemoglobina.
8. Ajustar la concentración de hemoglobina a 7 g/dl diluyendo con agua destilada.

Electroforesis

1. Sumergir las tiras de acetato de celulosa en una batea con solución tampón durante 10 minutos.
2. Llenar con solución tampón los dos fosos de la cubeta electroforética, teniendo cuidado de que los electrodos queden dentro y que la solución tampón no rebase los fosos y pase de una parte a otra de la cubeta.
3. Sacar las tiras de la solución tampón y eliminar el exceso poniendo las tiras entre dos hojas de papel de filtro.
4. Identificar la cara absorbente de cada tira de acetato de celulosa (superficie mate). Debido a la dificultad de su identificación tras estar ésta empapada en solución tampón, hay que recurrir a la señal con la que suelen dejar marcadas las casas comerciales.
5. Montar las tiras sobre el puente con la cara absorbente hacia arriba.
6. Fijar las tiras de acetato de celulosa con las pinzas del puente. Éstas deben quedar tensas y sus extremos dentro de la solución tampón.
7. Cargar el aplicador con la muestra. Para ello se coloca una gota de hemolizado sobre un vidrio de reloj. Se toca la gota con la ranura del aplicador de manera que ésta quede llena y sin rebosar.
8. Efectuar la aplicación de la muestra sobre la cara absorbente de la tira de acetato de celulosa. La aplicación se realiza a 1,5 cm del borde del cátodo (-) con el aplicador semimicro.
9. Conectar la fuente de alimentación a las cubetas, ajustando el voltaje a 200V.
10. Dejar pasar 60 minutos. Tras dicho tiempo desconectar fuente de alimentación y cubetas.

Coloración y decoloración

1. Poner las tiras, con la cara absorbente hacia abajo, en la batea del colorante Negro Amido. Sumergirlas durante 10 minutos.
2. Poner las tiras en una batea con ácido acético al 5%. Se agita la batea durante unos minutos y cuando el ácido acético está muy teñido de colorante se pasa a otra batea con el mismo contenido. Realizar estos pasos durante 3-4 veces en el mismo número de bateas, hasta que las tiras de acetato de celulosa adquieran color blanco.
3. Observar las bandas obtenidas y compararlas con el patrón. En un adulto normal aparecen tres bandas, la más cercana a la zona de aplicación se corresponde con la anhidrasa carbónica, una enzima intraeritrocitaria. La siguiente banda, alejándonos desde el punto de aplicación, se corresponde con la hemoglobina A₂. Y por último, la banda más alejada de todas se corresponde con la hemoglobina A.

Lectura densitométrica

1. Preparar una batea con solución transparentadora, mezclando la solución A y la solución B en proporción 9:1. Se transparentan y se deshidratan con la misma solución.
2. Poner las tiras de acetato de celulosa, recién decoloradas, en la batea con solución transparentadora.
3. Sacar las tiras de la solución transparentadora y extenderlas sobre una placa de vidrio, con la cara absorbente hacia arriba.
4. Eliminar las burbujas de aire de las tiras amasándolas con un rodillo o con un tubo de ensayo.
5. Calentar las tiras, sobre la placa de vidrio, en una estufa a 37ºC hasta que estén totalmente transparentes.
6. Enfriar, durante 15 minutos, las tiras de acetato de celulosa de manera lenta cubriendo la placa de vidrio con varias hojas de papel de filtro.
7. Separar las tiras de la placa de vidrio y realizar la lectura con el fotodensitómetro.

Lectura espectrofotométrica

1. Una vez realizada la lectura densitométrica, proceder con la elución.
2. Para la elución se hará uso de tiras de acetato de celulosa que estén húmedas y recién decoloradas (no transparentadas), rotulando tantos tubos como bandas se hayan obtenido en la electroforesis de hemoglobina. No hay que olvidar sumar un tubo más para el blanco.
3. Recortar las bandas de hemoglobina tras la decoloración, todavía húmedas, recortando también un trozo de tira blanca que se utilizará como blanco para la lectura del espectrofotómetro.
4. Disolver las bandas recortadas en solución eluyente. La banda de hemoglobina A₂ se disolverá en 3 ml mientras que la banda de hemoglobina A se hará en 9 ml. El blanco también se eluirá en 3 ml.
5. Leer con el espectrofotómetro la absorbancia de cada una de las disoluciones a 620 nm de longitud de onda.
6. Calcular el porcentaje de hemoglobina A₂ y de hemoglobina A con las siguientes fórmulas:
   

   

Resultado

Interpretación de los resultados

En la electroforesis de hemoglobina de una muestra de un adulto normal se ven tres franjas claramente diferenciadas:

• La banda que más ha migrado corresponde a la hemoglobina A. Es la más ancha.
• La siguiente banda, la segunda que más ha migrado, se corresponde con la hemoglobina A₂.
• Finalmente, la banda que menos ha migrado se corresponde con la anhidrasa carbónica.
• En ocasiones se puede apreciar una banda mucho más fina pegada a la banda de la hemoglobina A. Esta banda corresponde a la hemoglobina fetal (Hb F).

Se pueden apreciar alteraciones cuantitativas en las fracciones normales:

• Aumento de la banda de hemoglobina A₂ que se observa en la beta talasemia menor.
• Aumento de la banda de hemoglobina fetal que se observa en algunas talasemias y en la persistencia hereditaria de Hemoglobina F.

Por otro lado, se pueden apreciar alteraciones anormales:

• Aparición de una banda entre las hemoglobinas A y A₂, equidistante a ellas, que puede ser hemoglobina D o hemoglobina S (anemia falciforme).
• Aparición de una banda muy ancha en el lugar correspondiente a la hemoglobina A₂, que podría ser hemoglobina C o E.

Observaciones

En cuanto al hemolizado, hay que tener presente varias cosas:

• Si la sangre es anémica se utilizará mayor cantidad de sangre y menos de agua.
• En caso de que la sangre sea vieja, se añadirá cianuro potásico para convertir la metahemoglobina en cianmetahemoglobina, ya que la primera interfiere en la determinación de la hemoglobina H.
• Si no se utiliza el hemolizado, éste se puede guardar a 4ºC.
• La producción de metahemoglobina se puede evitar o reducir al máximo abreviando el contacto del plasma con los hematíes.

En cuanto a la técnica:

• El aplicador se debe lavar cuidadosamente entre cada aplicación.
• No hay que tocar la tira de acetato de celulosa por la zona central.
• No hay que dejar aire atrapado entre la tira y el tampón.
• La electroforesis, sea de proteínas séricas o de hemoglobina, siempre debe realizarse paralelamente a la electroforesis de la sustancia patrón.