Determinación de la metahemoglobina

La Determinación de la metahemoglobina es una práctica que realicé en la asignatura de hematología. Durante el primer curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Determinación de la metahemoglobina

Objetivo

Aprender a realizar la determinación de la metahemoglobina.

Fundamento

La metahemoglobina es la hemoglobina que tiene el hierro en forma oxidada (Fe3+) cuya característica principal es el déficit de función respiratoria. La metahemoglobina puede ser congénita o debida a intoxicaciones.

Determinación de la metahemoglobina

La determinación de la metahemoglobina se basa en que ésta tiene dos picos de absorción espectrofotométrica (522 y 578 nm). Esta característica se emplea para diferenciarla de otras hemoglobinas en un preparado de sangre hemolizada. La relación existente, entre las absorbancias de ambas longitudes de onda, se utiliza para realizar los cálculos.

La proporción de metahemoglobina de la muestra problema se calcula sobre una recta patrón realizada con los valores obtenidos a partir de una muestra patrón con y sin ferricianuro potásico.

Material

  • Tubos de ensayo
  • Pipetas
  • Peras para pipetas
  • Centrífuga
  • Vortex
  • Cucharilla o espátula
  • Cubeta de espectrofotómetro
  • Fotocolorímetro o espectofotómetro
  • Papel milimetrado

Reactivos

  • Sangre anticoagulada con EDTA
  • Solución salina fisiológica
  • Tampón fosfato 0,01M a pH 6,5
  • Ferricianuro potásico
  • Agua destilada

Técnica

  1. Lavar tres veces los hematíes de la muestra patrón y de las muestras problema con solución salina fisiológica. Centrifugar en cada lavado a 1500 rpm durante 5 minutos.
  2. Mezclar, en tubos rotulados, 20 microlitros de hematíes lavados con 3 ml de tampón fosfato.
  3. Utilizar un vortex para romper los hematíes.
  4. Incubar en nevera durante 10 minutos.
  5. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm.
  6. Preparar nuevos tubos rotulados con 2 ml de solución tampón fosfato en cada uno. Para la muestra patrón se preparan dos tubos.
  7. Añadir a cada uno de estos nuevos tubos 1 ml del sobrenadante obtenido tras la centrifugación.
  8. Añadir a uno de los tubos patrón dos o tres microcristales de ferricianuro potásico.
  9. Leer la absorbancia de todos los tubos a 578 nm frente a agua destilada (blanco).
  10. Leer la absorbancia a 522 nm frente al mismo blanco del punto anterior.
  11. Calcular la relación entre la absorbancia a 578 nm y a 522 nm para cada una de las muestras, así como para la muestra patrón con y sin ferricianuro.
    Determinación de la metahemoglobina
  12. Realizar una recta patrón.

Resultado e interpretación

Determinación de la metahemoglobina
Centrifugación de la muestra de sangre.
Determinación de la metahemoglobina
Separamos el plasma y lo guardamos en tubos eppendorf para poder congelarlo. Sería útiles en futuras prácticas.
Determinación de la metahemoglobina
Lavando los hematíes.
Determinación de la metahemoglobina
Lisando los hematíes mediante el uso de un vortex.
Determinación de la metahemoglobina
Incubando en nevera a 4ºC durante 10 minutos.
Determinación de la metahemoglobina
Muestra y patrones listos para ser leídos por el espectrofotómetro/fotocolorímetro.
Determinación de la metahemoglobina
Recta de calibración de la determinación de la metahemoglobina. Es una representación ficticia sin datos reales.

Observaciones

Como el patrón y la muestra contienen la misma sangre, se altera la muestra con un poquito de ferricianuro potásico en el paso final.

Se me han traspapelado los resultados y no he podido representar la recta patrón con datos reales. Al no tener la recta tampoco he podido extrapolar la absorbancia del resultado para obtener el porcentaje de concentración de metahemoglobina.

Deja un comentario

Uso de cookies

Este sitio web utiliza cookies para que usted tenga la mejor experiencia de usuario. Si continúa navegando está dando su consentimiento para la aceptación de las mencionadas cookies y la aceptación de nuestra política de cookies, pinche el enlace para mayor información.plugin cookies

ACEPTAR
Aviso de cookies