Determinación cuantitativa de Fosfatasa Alcalina

La Determinación cuantitativa de Fosfatasa Alcalina es una práctica que realicé en la asignatura de bioquímica clínica. Durante el segundo curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Determinación cuantitativa de Fosfatasa Alcalina

Objetivo

Determinar la concentración de fosfatasa alcalina en una muestra problema.

Fundamento

La fosfatasa alcalina es una enzima que se encuentra presente en casi todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta su presencia en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón. Tiene importancia clínica tanto su aumento como su disminución de los niveles en plasma.

Las causas más probables de aumento del nivel de FAL son la enfermedad ósea de Paget, obstrucciones hepáticas, hepatitis, hepatotoxicidad por medicamentos y osteomalacia. Por otro lado, las causas más probables de disminución del nivel de FAL son el cretinismo y el déficit de vitamina C.

Determinación cuantitativa de Fosfatasa Alcalina.

La fosfatasa alcalina (FAL) cataliza la hidrólisis del p-nitrofenilfosfato (pNPP) a pH 10,4 liberando p-nitrofenol y fosfato.

La velocidad de formación del p-Nitrofenol, determinado fotométricamente, es proporcional a la concentración catalítica de fosfatasa alcalina en la muestra problema.

Material y reactivos

  • Cubetas de espectrofotómetro
  • Fotocolorímetro/Espectrofotómetro
  • Micropipetas
  • Puntas de micropipetas
  • Papel de filtro
  • Suero sanguíneo problema
  • Cronómetro
  • Agua destilada o desionizada
  • Kit Fosfatasa alcalina de la casa comercial BSM

Técnica

  1. Preparar el reactivo R a base de 1 volumen de R2 y 4 volúmenes de R1.
  2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
  3. Pipetear en una cubeta:
    Determinación cuantitativa de fosfatasa alcalina
  4. Mezclar e incubar durante 1 minuto a temperatura ambiente.
  5. Leer la absorbancia (A) inicial de la muestra, poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia cada minuto durante 3 minutos.
  6. Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (A/min).

Resultado e interpretación

La lectura de las absorbancias fueron realizadas a 405 nm de longitud de onda:

  • Inicial: 0,107
  • Primer minuto: 0,328
  • Segundo minuto: 0,331
  • Tercer minuto: 0,336

Una vez obtenidas las absorbancias, se realiza el cálculo del incremento de absorbancias/minutos. El resultado obtenido es de 0,076. Este resultado debe multiplicarse por 3300 para completar la determinación cuantitativa de fosfatasa alcalina.

  • 0.076 * 3300 = 251.9 U/L de Fosfatasa alcalina

Los valores de referencia para un adulto, con la muestra atemperada a 37ºC, son de 98-279 U/L. Por tanto se encuentra dentro de los valores normales

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