Determinación cuantitativa de Antitrombina III

La Determinación cuantitativa de Antitrombina III es una práctica que realicé en la asignatura de hematología clínica. Durante la segunda evaluación del primer curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Determinación cuantitativa de Antitrombina III

Objetivo

Conocer la Antitrombina III de un paciente para explorar la regulación de la coagulación de un paciente.

Fundamento

La Antitrombina III (AT III) es una proteína sintetizada en el hígado que se encuentra presente, normalmente, en el plasma humano. Es el inhibidor más importante de la trombina. Inhibe a la coagulación limitando la formación del coágulo sanguíneo.

La Antitrombina III inactiva otros factores de la cascada de coagulación como el factor Xa, la plasmina y los factores IX, X, XI y XII.

El déficit de AT III puede causar trombosis, la formación de coágulos en los vasos sanguíneos. Los coágulos que se forman en las extremidades inferiores y el tromboembolismo pulmonar son algunos ejemplos.

La deficiencia de esta proteína es normalmente hereditaria, afectando a hombres y mujeres por igual. La deficiencia de Antitrombina III adquirida puede aparecer como resultado de otras condiciones como enfermedades hepáticas, tratamientos con quimioterapia o el uso de anticonceptivos orales. También aparece en el síndrome nefrótico y en la Coagulación Intravascular Diseminada (CIVD).

Determinación cuantitativa de Antitrombina III

En la turbidimetría se mide la cantidad de luz bloqueada, es decir, la que no es transmitida por la suspensión y que no es capaz de llegar al fotodetector. Cuanto mayor es la luz bloqueada (cuantificada en un espectrofotómetro en forma de absorbancia) mayor es el número de partículas presentes en la suspensión y más alta es la concentración de la sustancia problema que da lugar a esas partículas.

Si un antígeno y un anticuerpo se combinan en un medio líquido, se forman agregados de inmunocomplejos que quedan en suspensión dando un aspecto turbio a este líquido. Cuando las partículas que se detectan por turbidimetría son inmunocomplejos se denomina inmunoturbidimetría.

Material

  • Micropipetas automáticas de 20, 100 y 1000 microlitros
  • Puntas de micropipeta
  • Papel de filtro
  • Guatix
  • Espectrofotómetro
  • Cubetas de espectrofotómetro

Reactivos

  • Calibrador de Antitrombina III de 77 mg/dl
  • Suero salino fisiológico
  • Agua destilada
  • Diluyente (R1) – Tampón Tris 20 mmol/L, PEG 8000, pH 8,3 y ázida sódica 0,95 g/L
  • Anticuerpo (R2) – Suero de cabra, anti-antitrombina III humana, pH 7,5 y ázida sódica 0,95 g/L
  • Plasma control, a modo de muestra, de 96 mg/dl. Se debe diluir a 1/2 porque su valor se sale del límite de linealidad del método establecido para esta prueba y que está fijado en 70 mg/dl

Técnica

  1. Preparar la recta de calibración utilizando el calibrador de la siguiente manera (A2 – A1):
  2. Atemperar los reactivos a 37ºC.
  3. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada y ajustar las lecturas a 340 nm de longitud de onda.
  4. Pipetear en una cubeta 800 microlitros de R1 y 20 microlitros de muestra o calibrador.
  5. Mezclar y leer la absorbancia (A1) después de la adición de la muestra.
  6. Inmediatamente después pipetear en la cubeta 200 microlitros de R2.
  7. Mezclar y leer la absorbancia (A2) 5 minutos después de añadir el reactivo R2.

Resultado

Las absorbancias obtenidas fueron 0,605 (A2) y 0,403 (A1), por lo que la resta de ambos da una cifra de 0,202.

Extrapolamos ese valor en la recta de calibración y obtenemos 17,8 mg/dl. Como la muestra control se diluyó a 1/2 porque sobrepasaba el límite de linealidad del método tendremos que multiplicar por la inversa de la dilución dando 35,6 mg/dl de concentración de Antitrombina III.

Determinación cuantitativa de Antitrombina III
Reactivo R1 correspondiente al kit comercial de la casa Spinreact.
Determinación cuantitativa de Antitrombina III
Lectura de la absorbancia 1.
Determinación cuantitativa de Antitrombina III
Lectura de la Absorbancia 2.
Determinación cuantitativa de Antitrombina III
Recta de calibración de la Determinación cuantitativa de Antitrombina III. Click en la imagen para ampliar.

Interpretación de los resultados

Están descritos en el fundamento de la práctica, salvo los valores de referencia que son 17-30 mg/dl.

Estamos ante una muestra control de 96 mg/dl que ha dado un resultado de 35,6 mg/dl. Esto puede ser debido a que el control estaba en mal estado o a que la técnica y la recta de calibración no se han realizado correctamente.

Observaciones

La bilirrubina, hemoglobina, lípidos y factores reumatoides pueden interferir en determinadas concentraciones dentro de la muestra, alterando el resultado de la concentración de Antitrombina III.

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