Cuantificación de Hemoglobina Fetal por el método de Betke

La Cuantificación de hemoglobina fetal por el método de Betke es una práctica que realicé en la asignatura de hematología. Durante el primer curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Cuantificación de hemoglobina fetal por el método de Betke

Objetivo

Aprender a realizar el método de Betke, cuantificando la hemoglobina fetal tras la desnaturalización alcalina del resto de hemoglobinas.

Fundamento

La hemoglobina fetal es más resistente a la desnaturalización producida por álcalis que las hemoglobinas A y A₂. Si un hemolizado se somete a la acción de una solución alcalina, las hemoglobinas A y A₂ serán desnaturalizadas, quedando intacta la hemoglobina fetal (hemoglobina F).

Cuantificación de hemoglobina fetal por el método de Betke

Si después de que haya actuado el álcali se determina la concentración de hemoglobina por el método de la cianmetahemoglobina, los resultados serán referidos a la hemoglobina fetal.

Para que los restos de las hemoglobinas desnaturalizadas no interfieran en los resultados, se les hace precipitar con sulfato amónico.

Material

• Tubos de ensayo
• Gradillas de tubos
• Papel de filtro
• Sangre anticoagulada con EDTA
• Pipetas de 50, 200, 500 y 1000 microlitros
• Pipetas pasteur
• Espectrofotómetro
• Centrífuga

Reactivos

• Reactivo de Drabkin
• Agua destilada
• NaOH al 5% m/v
• Sulfato amónico

Técnica

1. Centrifugar 5 minutos a 3000 rpm la sangre total anticoagulada.
2. Separar los hematíes del plasma y guardar éste en un tubo eppendorf que irá al congelador.
3. Preparar el hemolizado mezclando 0,5 volúmenes de hematíes, 0,75 volúmenes de agua destilada y 0,25 de cloroformo.
4. Agitar y centrifugar a 3000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante obtenido es el hemolizado.
5. En un tubo echar 300 microlitros de reactivo de determinación de hemoglobina y 14,7 ml de agua destilada. El resultado obtenido es de 15 ml de reactivo de Drabkin.
6. Mezclar 0,6 ml de hemolizado con 10 ml de Drabkin, obteniendo una disolución de cianmetahemoglobina.
7. Rotular 4 tubos y llenarlos de la siguiente manera:
   
   
   
8. Agitar los tubos y dejar reposar.
9. Centrifugar durante 10 minutos a 3000 rpm.
10. Rotular 4 tubos iguales que los anteriores.
11. Filtrar los tubos anteriores en los nuevos con papel de filtro.
12. Diluir el contenido del tubo de hemoglobina total 9:1 con agua destilada (9 ml de agua destilada y 1 ml de hemoglobina total).
13. Leer la absorbancia de los tubos a 415 nm de longitud de onda frente a agua destilada.
14. Calcular el porcentaje de hemoglobina fetal del paciente.

Interpretación de los resultados

Los valores de referencia de hemoglobina fetal son inferiores al 1% de la hemoglobina total. Un valor elevado podría significar una Beta-Talasemia o una persistencia hereditaria de hemoglobina fetal.

Observaciones

Por desgracia tuve que faltar a clase el día que se realizó esta práctica. Debido a ello no puedo adornar la práctica con resultados y con fotografías de la misma.