Cuantificación de Hemoglobina A2

La Cuantificación de Hemoglobina A2 es una práctica que realicé en la asignatura de Hematología. Durante el primer curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Cuantificación de Hemoglobina A2

Objetivos

Realizar una cuantificación cromatográfica-espectrofotométrica de hemoglobina A2.

Fundamento

La hemoglobina es una proteína que se encuentra en disolución en el citoplasma del hematíe. Y dentro de cada hematíe se encuentran unos seiscientos millones de moléculas de esta proteína, cuya función principal es la de fijar de forma reversible el oxígeno molecular (O2), facilitando su transporte desde los pulmones a los tejidos.

La hemoglobina A es la predominante en una persona adulta, constituyendo el 96-98% de la hemoglobina total. La hemoglobina A2 el 2-3%, mientras que la hemoglobina F, predominante en el feto, constituye el 1%.

Cuantificación de Hemoglobina A2

En la utilización de una columna cromatográfica, tras la preparación previa de un hemolizado, las hemoglobinas son retenidas por una resina de intercambio aniónico. La hemoglobina A2 se eluye de forma específica bajo estrictas condiciones de pH y fuerza iónica, cuantificándose por lectura espectrofotométrica a 405 nm de longitud de onda.

A pH 7,6 la hemoglobina A2 se encuentra en su punto isoeléctrico, sin carga. Las demás hemoglobinas se encuentran cargadas negativamente, por lo que quedan retenidas en la resina de la columna cromatográfica, que tiene moléculas con carga positiva.

Material

  • Papel de filtro
  • Espectrofotómetro
  • Tubos de ensayo
  • Gradillas de tubos
  • Pipetas pasteur
  • Pipetas de vidrio
  • Vortex
  • Micropipetas automáticas
  • Puntas de micropipeta

Reactivos

  • Sangre anticoagulada con EDTA
  • Agua destilada
  • Kit de hemoglobina A2 de la casa comercial BioSystems
    • Reactivo: Tampón biológico 15 mmol/L, detergente 0,1 g/L, pH 7,6
    • Microcolumnas cromatográficas con resinas de intercambio aniónico

Técnica

  1. Pipetear en un tubo de ensayo 50 microlitros de sangre problema y 200 microlitros de agua destilada.
  2. Pasar el tubo por el Vortex para obtener el hemolizado.
  3. Dejar reposar el hemolizado 5 minutos a temperatura ambiente.
  4. Destapar la parte superior de la microcolumna, romper a continuación la lengüeta inferior y bajar el disco superior hasta el nivel de la resina, evitando comprimirla, con la ayuda del extremo plano de una pipeta. Dejar gotear hasta que el líquido alcance el nivel del disco, desechando el eluído.
  5. Aplicar sobre el disco superior, cuidadosamente, 50 microlitros de hemolizado y desechar el eluído.
  6. Cuando haya penetrado todo el hemolizado, añadir, procurando arrastrar los restos del mismo, 200 microlitros del reactivo.
  7. Colocar la microcolumna sobre un tubo de ensayo y añadir 3 ml de reactivo, recogiendo después el eluído.
  8. Homegeneizar y leer la absorbancia del eluído (hemoglobina A2) a 405 nm de longitud de onda frente a agua destilada.
  9. Pipetear en un tubo de ensayo 12 ml de agua destilada y 50 microlitros de hemolizado.
  10. Homegeneizar y leer la absorbancia (hemoglobina total) a 405 nm de longitud de onda frente a agua destilada.

Resultado

Cuantificación de hemoglobina A2
Material necesario para la práctica de la cuantificación de hemoglobina A2.
Cuantificación de hemoglobina A2
Microcolumna cromatográfica reteniendo las hemoglobinas del hemolizado excepto la hemoglobina A2.

Una vez realizadas las lecturas espectrofotométricas, se procedió a realizar los cálculos siguiendo el protocolo de la práctica:

Interpretación de los resultados

El intervalo de referencia es de 1,3% – 3,7% de hemoglobina A2.

Si el resultado obtenido es de 4% – 10% de Hb A2 se corresponde con el rasgo Beta-talasémico.

Valores superiores al 10% hacen pensar en hemoglobinopatía C, ya que la hemoglobina C se eluye junto a la hemoglobina A2.

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