Cianmetahemoglobina

El método de la Cianmetahemoglobina es una práctica que realicé en la asignatura de hematología clínica. Durante la segunda evaluación del primer curso de mis estudios del CFGS de Laboratorio de Diagnóstico Clínico.

Título

Cianmetahemoglobina

Objetivo

Determinar la concentración de hemoglobina en sangre por el método colorimétrico de la Cianmetahemoglobina.

Fundamento

Una hemoglobinometría se puede realizar por varios métodos:

  • Colorimétricos
  • Gasométricos (Determina la cantidad de O2 unido a la hemoglobina)
  • Densitométricos (Compara muestras de sangre con disoluciones de H2SO4)
  • Químicos (Determina el hierro unido a la hemoglobina)

Los métodos como la hematina ácida son muy subjetivos, motivo por el que el comité para la estandarización de la hematología propuso este método como un estándar para determinar la hemoglobina. La cianmetahemoglobina es un método muy preciso, muy exacto y de fácil estandarización.

Las soluciones de cianmetahemoglobina son muy estables y permiten elaborar curvas de referencia y de calibracion. La cianmetaHb presenta una banda ancha de absorción a 540 nm de longitud de onda.

Método de la Cianmetahemoglobina

Este método se basa en tres pasos:

  1. Hemolizar la muestra sanguínea problema para liberar la hemoglobina del interior de los hematíes y obtener así una disolución de hemoglobina con la cual trabajar.
  2. Convertir la hemoglobina en cianmetaHb por acción de una mezcla de ferricianuro potásico y cianuro potásico. La cianmetaHb es una sustancia estable de color rojizo/pardo.
  3. Determinar la absorbancia de la disolución de cianmetahemoglobina con una lectura a 540 nm de longitud de onda.

Hasta hace pocos años se utilizaba el reactivo de Drabkin, un reactivo preparado a base de ferricianuro potásico y cianuro potásico. En la actualidad se utiliza el reactivo de determinación de la hemoglobina, que es un reactivo 50 veces más concentrado que el anterior.

La hemoglobina, en contacto con ferricianuro potásico, se oxida dando lugar a metahemoglobina. Ésta, en contacto con cianuro potásico, se transforma en cianmetahemoglobina.

Material y reactivos

  • Muestra de sangre anticoagulada con EDTA
  • Fotocolorímetro
  • Tubos de ensayo
  • Reactivo de determinación de hemoglobina o, en su defecto, reactivo de Drabkin
  • Patrón de hemoglobina de 15 g/dl
  • Agua desionizada
  • Papel de filtro
  • Gradilla de tubos

Técnica

  1. Rotular tres tubos de ensayo con los nombres: Blanco, Muestra y Patrón.
  2. Poner en cada tubo 4,9 ml de agua destilada.
  3. Añadir 0,1 ml de reactivo en los tres tubos.
  4. Poner 20 microlitros de muestra de sangre homogeneizada al tubo rotulado con «Muestra».
  5. Añadir 20 microlitros del patrón de hemoglobina al tubo «Patrón». Llegados a este punto conviene aclarar que si el patrón de hemoglobina requiere reactivo de Drabkin, habrá que añadirlo. Si el patrón es directamente un patrón de cianmetahemoglobina entonces no habrá que añadir Drabkin.
  6. Esperar 5 minutos para que ocurra la hemólisis en el tubo «Muestra» y se transforme toda la hemoglobina en cianmetahemoglobina.
  7. Leer la absorbancia de los tubos a 540 nm en el fotocolorímetro, anotar los resultados y realizar el cálculo de la concentración de hemoglobina presente en la muestra.

Resultado

El resultado de la concentración de hemoglobina viene dado por la siguiente fórmula:

Cianmetahemoglobina

La absorbancia obtenida de la muestra fue de 0,378 mientras que la del patrón fue de 0,318. Si se aplica la fórmula se obtendrá una concentración de hemoglobina superior a 17 g/dl.

Cianmetahemoglobina
Preparando los tubos para la práctica.
Cianmetahemoglobina
Preparación de los tubos para la práctica.
Cianmetahemoglobina
Blanco, patrón y muestras listos para ser leídos en el fotocolorímetro. Se observa el color pardo de la cianmetahemoglobina.
Cianmetahemoglobina
Leyendo los tubos.
Cianmetahemoglobina
Lectura realizada por el fotocolorímetro de uno de los tubos con cianmetahemoglobina.
Cianmetahemoglobina
Recopilación de resultados utilizando las técnicas de la cianmetahemoglobina y de la hematina ácida.

Observaciones

Las lecturas fueron realizadas a 546 nm de longitud de onda en lugar de a 540 y algunos grupos utilizaron sangre anticoagulada con citrato.

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